植物病毒的脱除处理技术

第四节　植物病毒的脱除处理技术

病毒一般为系统性感染，一旦侵入植物体内，很难根除，并可随植物性繁殖材料或种子传播给下一代，且在植物种苗和繁殖材料的调运过程中很容易使病毒传到异地。由于病毒危害大，且无有效防治方法，在国际和地区间种质交换过程中，一般要求繁殖材料不能带有某些病毒。因此，无论是调入或调出的繁殖材料都应经过严格的检疫，对发现带有目标病毒的材料销毁或作去病毒处理。常用的脱除病毒的途径有热处理、茎尖培养、微芽嫁接及化学处理等方法。

一、热处理脱病毒

热处理也称温热疗法（ther’motherapy），是脱病毒处理中应用最早和最普遍的方法之一。这种方法是利用病毒与植物的耐热性不同，将待处理的植物材料在高于正常温度的环境条件下处理一定的时间，使植物体内的病毒失去活性或钝化，而植物的生长受到较小的影响或在高温条件下生长加快，这样植物的新生部分不带病毒，取该无病毒组织培育即可获得无病毒植株。

用于病毒脱除的热处理方法主要采用高温空气处理。高温空气处理即是将待脱病毒的材料在热空气中暴露一定时间，达到脱除病毒的目的，这种方法在马铃薯、多种花卉及果树病毒的脱除获得成功，是病毒脱除中最常用的方法。每种植物都有其临界的高温处理范围，超过此温度范围或处理时间过长，易使植物的组织受到伤害，甚至导致植株的死亡。

高温空气热处理脱病毒的主要环节包括材料的准备、热处理和再培养。

1.热处理材料

热处理材料可以是离体植株，也可以是盆栽植株。盆栽植株的热处理一般放在专门设计的处理箱中进行处理。要求处理箱能保障盆栽苗有足够的生长空间和生长所需的光照强度及湿度，能达到并控制所需温度。离体植株的热处理即是采用离体培养（通常为茎尖培养）所获试管苗，在超过正常生长的温度条件下进行处理。一般可以在实验室常用的光照培养箱进行处理。

2.热处理条件

热处理温度及时间因病毒种类和植物的耐热性而异，有些病毒在34℃左右即可脱除，而另一些病毒需要在39～42℃下才能脱除。在植物耐热性允许的范围内，热处理的温度越高，脱病毒效果越好，使用较多的是37℃左右。处理的温度和时间也受待处理材料的限制，有些植物或品种不耐高温，为了减少高温对植物的损伤，采用白天40℃处理16h，夜间30℃处理8h交替进行，这种高低温交替处理的方法称为变温热处理。在高温下连续处理一定时间的方法，称为恒温热处理。处理的时间，因病毒的不同差异较大，可以是28～90d。有研究表明变温热处理的脱毒效果较恒温热处理好，如柑橘速衰病毒（CTV）幼苗黄化株系，在38℃处理8周不能脱除，而在变温条件下处理8周即可脱除。

3.热处理材料的再培养

高温空气处理使病毒增殖和扩散减缓，而植株生长加快，处理的植株新梢顶端不带病毒，但是这种处理不能使病毒完全失活，停止处理一段时间，病毒即可扩散至整个植株。因此，处理后应立即取茎尖嫁接或离体培养才可获得脱病毒植株。一般而言所取茎尖越小，获得脱病毒植株的概率越大，但嫁接成活率会相应降低。茎尖嫁接要求技术高，有时不易成功。因此，对于组织培养容易成功的植物材料，在有培养条件的情况下宜采用茎尖离体培养的方法进行再培养。

二、茎尖培养脱病毒

茎尖培养，也叫分生组织培养或生长点培养。因此，茎尖培养脱病毒是采用生物学技术进行病毒的脱除。由于病毒在植物体内分布不均匀，在顶端生长点的分生组织病毒浓度低，部分细胞不带病毒，取顶端生长点培养可获得无病毒植株。但不含病毒的部分是极小的，一般不超过0.1～0.5mm。

早在1943年，White采用离体培养的方法成功地培养了感染烟草花叶病毒（TMV）的番茄根，发现根尖部分不存在病毒。Morel等人（1952）从感染花叶病毒和斑萎病毒的大丽花植株上切取茎尖培养，获得了无病毒植株，从而为拯救优良品种开辟了一条新的有效途径。采用茎尖培养脱病毒技术已经被广泛采用，取得了良好的效果。

1.茎尖培养脱病毒的基本程序

采用茎尖培养技术脱病毒一般包括以下几个步骤：培养基的选择与制备、待脱病毒材料的消毒处理、茎尖的剥离与培养、诱导分化和小植株的增殖、诱导生根和移栽。有关不同植物的茎尖培养具体操作方法可参阅有关的专著，在此不作详细介绍。

茎尖培养成败的关键在于寻找合适的培养基，与一般组培用培养基一致，这些培养基包括大量元素、微量元素及无机成分，由这三类成分构成的培养基称为基础培养基。此外，还须加入必要的生长调节物质，如赤霉素（GA）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、激动素（KT）、2，4-D和6-BA等。有些植物的茎尖培养还需加入天然复合物，如椰乳、酵母或麦芽精提取液等。诱导分化、增殖和生根所需培养基因植物种类不同而有差异，最常用的是MS培养基，所添加的生长调节剂种类、浓度等因植物种类或品种的不同而进行适当调整。

2.茎尖大小与脱病毒的关系

在以脱病毒为目的的茎尖培养过程中，对材料的选择要求更为严格，一般应选取外表生长健康、品种优良生长旺盛的新梢或植株的茎尖进行培养。茎尖即是指茎端分生组织以及由数个叶原基组成的部分。分生组织的形态和大小，依植物品种、生长期以及外界环境的影响而有变化，因此剥离茎尖的难易程度也不同。

剥离的茎尖大小与脱病毒的成败直接相关，一方面它关系到茎尖培养能否成活，另一方面，决定着成活后所获得的植株是否带有病毒。一般而言，茎尖培养时切取的茎尖越小，脱病毒的效率越高。如有人试验发现切取草莓茎尖大小为0.2～0.3mm时，脱病毒率可达100％，而茎尖为1.0mm时，所获植株的脱病毒率仅为50％左右。但茎尖过小时培养成活率会大大降低，而且操作难度也很大。因此，脱病毒时要兼顾脱毒率和成活率两个方面，一般切取长度为0.2～0.5mm且带有1～2个叶原基的茎尖比较合适，这样大小的茎尖既可保证一定的成活率，又能使一定数量的茎尖苗不带有病毒。

3.茎尖培养与热处理相结合脱病毒

茎尖培养有时不能完全脱除病毒，对带病毒的茎尖培养植株可采用前述的热处理方法进行处理，使病毒钝化而扩大茎尖的无病毒区，然后取较小的顶端分生组织再培养。用这种方法获得无病毒植株的概率更大，可以明显提高脱毒效果，采用该策略成功脱除病毒的事例很多，已在许多植物的脱病毒中得到应用。

用离体培养植株进行热处理一般可在光照培养箱中进行，处理前选用生长健壮一致的单株转接到新制备的培养基中，以便使植株在处理过程中可获得足够的营养快速生长。处理时间和温度与常规热处理相同，处理完毕立即取茎尖再培养，所取茎尖大小因植物种类和待脱病毒种类而异，一般为0.5～2mm。

三、微芽嫁接脱病毒

微芽嫁接是在无菌条件下，切取待脱病毒样品的茎尖嫁接到试管中培养的实生砧木苗上，愈合发育为完整植株，达到脱病毒的效果。这种技术首先成功应用于柑橘脱病毒，以后逐渐应用到其他多种果树病毒的脱除。微芽嫁接已成为柑橘脱病毒良种培育的常规方法，得到广泛的应用。在西班牙，Navarro等（1977）采用该技术脱除柑橘病毒，脱毒株率达80％以上。有人试验，从试管培养10～14d的桃离体植株，切取0.5～1.0mm带有3～4个叶原基的茎尖进行嫁接，成活率达到40％～70％，获得了脱除李属坏死环斑病毒（PNRSV）、李矮缩病毒（PDV）和苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）的桃苗。微芽嫁接不仅是获得无病毒种苗的方法之一，同时还可解决某些植物营养繁殖生根难的问题。

以柑橘为例微芽嫁接的基本程序包括以下3个步骤：

（1）试管砧木苗的准备因柑橘病毒一般不能通过种子传染，因此可用种子长成的实生苗作砧木。种子去内、外种皮，用0.5％次氯酸钠溶液浸泡消毒10min，再用灭菌水洗3～4次，然后放入盛有MS琼脂培养基的试管中，每管3～5粒，置25～27℃下暗培养14d左右。

（2）茎尖嫁接在超净工作台上进行，从试管中取出黄化幼苗，去掉子叶和上胚轴上端，并将根系适当截短，在离上胚轴顶端约0.5cm处向下斜切一深至木质部、长约2～3mm的斜切口，再在斜切口末端横切一刀，挑去切下部分。在体视显微镜下，从待脱病毒样品上取约0.2mm的茎尖，放于切口的水平面上，切面朝下与砧木横切面维管束组织紧密接触。

（3）嫁接苗培养嫁接后的砧木苗放人装有MS液体培养基的平底试管中，每管一株，并以滤纸桥支撑嫁接苗，置27℃下恒温培养。一周即可产生愈伤组织，5～6周长出4～6片叶后，可移入无菌的珍珠岩中保湿培养。

四、化学处理脱病毒

已发现有些化学物质对植物病毒的复制和扩散有一定的抑制作用。抗病毒醚（ribavi rin）是一种对病毒具有广谱抑制作用的人工合成核苷类物质，商品名称为“Virazole”。此外，DHT（2，4-dioxohexa-hydro-1，3，5-triazine）对病毒也有类似的作用。采用该类化合物处理植物材料，可抑制植物中病毒的复制和移动，使植株的新生部分不带病毒，取无病毒组织繁殖可获得无病毒植株。

在植物脱病毒研究中，化学处理往往与组织培养结合进行，即先获得待脱病毒样品的茎尖培养植株，然后在进行离体植株培养的培养基中加入化学抑制物质，继代培养一定时间后，再取新梢在无化学抑制剂的培养基上培养，经病毒检测，保留无病毒的单株。

除上述常用脱病毒技术外，花药培养、超低温处理等技术在多种植物病毒脱除中得到成功应用。

在众多的脱病毒方法中，具体应用时可因待脱病毒植物种类或品种、感染的病毒种类以及具备的条件选用适当的技术。无论采用哪一种方法，都不可能达到一次完全脱除所有病毒的效果，因此，脱病毒处理获得的再生植株，必须经过严格的病毒检测。