制作和保存

第一节　病害标本的采集、制作和保存

一、材料和用具

标本夹、标本纸、采集箱、剪刀、小刀，纸袋、塑料袋、标签、麻绳、记载本、显微镜、镊子、挑针、载玻片、盖玻片、标本瓶、酒精灯、贮水滴瓶、电炉（1000W）、瓷盆（直径40 cm）、大烧杯（1000ml）、酒精灯、甲醛、酒精、蒸馏水、量杯或量筒（500 ml、1000ml）、醋酸铜、硫酸铜等。

二、内容、方法及步骤

（一）植物病害标本的采集

植物病害种类很多，各种病害标本的采集方法各有不同。一个合格的标本，必须具有植物受害部位及各时期比较明显的典型症状，尽可能有病征（病原物）存在。采集病害标本时应注意：

1.病状典型

病状是确定一种病害的重要依据。采集病害标本，不仅要有某一受病部位的典型病状，而且还应具有不同时期、不同部位的病状标本，如稻瘟病，应采集苗瘟、叶瘟、节瘟、枝梗瘟、穗颈瘟、谷粒瘟等各个时期的典型病状，而且叶瘟中应有急性型、慢性型、白点型和褐点型等的典型病状标本。

2.病征完整

采集时一定要注意，为了进一步鉴定病害，对有病征的标本要重点采集，如真菌性病害在感病部位往往有各种霉状物、小黑点等病征存在，细菌性病害往往有菌脓溢出。有转株寄主的锈病应该尽量找到第二寄主标本。真菌病害的病原菌包括有性和无性两个阶段，应在不同时期分别采集。有的真菌在活寄主上常不产生子实体，在枯死株上有病征，因此，对地面上的枯枝落叶也应注意采集，注意在病原有性阶段产生子实体的时期采集，如白粉病叶片上的小颗粒（有性阶段的闭囊壳）。

3.避免病原物混杂

采集时将容易混杂污染的标本分别用纸包好，如采集黑粉病类标本及腐烂的果实等时必须注意分装，以免污染其他枝叶类标本，影响鉴定。

4.采集记载

没有记录的标本或记录不全的标本将失去使用价值。必须记录寄主名称，这是鉴定病害的前提。对寄主植物不熟悉的只凭标本识别病害是非常困难的，对不熟悉的寄主，还要采集寄主的叶、花、果实等，以便进一步鉴定。记录内容包括寄主名称、采集日期、采集地点、采集人姓名、标本编号、分布情况、地理条件、损失率、防治办法及效果等。以上内容除记在记录本上外，还应在标本上挂标签，注明内容包括标本编号、采集时间、地点、采集人姓名等。不同的标本，不同产地的同一标本，应分别编号。记录要长期保存，以便进行查对，应注意每份标本的记录和标签上的编号必须相同。

5.临时保存标本的压制

对于容易干燥蜷缩的叶部病害标本，如禾本科植物病害标本，易打卷成筒状，应随采随压制，或用塑料袋装好，并封口，或用湿布包好，采回后马上整形压制。也可用吸水性较强的书籍在田间将病叶临时夹压。

（二）植物病害标本的制作

1.蜡叶标本的制作

蜡叶标本是一种制作简单、经济、能保持植物病害症状原形的标本。便于交换、鉴定或做展览用。蜡叶标本的制作要求是在短时间内把标本压平干燥、使其尽量保持原有的形态和颜色，具体操作时要注意：

（1）随采随压采集标本后，要马上放入标本夹中压制，可保持标本的原形，减少压制过程中的整形工作。有许多标本在压制时，需要作少量的加工，如标本的叶子过多、茎或枝条粗大时，在压制时最好把叶子剪掉一部分或将枝条剪去一侧再压制，如玉米大斑病叶，因叶片较宽，较长，可以根据病斑的大小，剪取有病斑的一部分压平，过多的叶片重叠还使标本受力不匀而变色、变形。有的标本是整株的，如水稻、小麦茎叶标本，可折成“N”字形压制。

（2）勤换勤翻因为植物本身含水量大，为了使标本上的水分尽快被标本纸吸收，使标本尽量保持原色，要勤换勤翻。标本放到标本夹里以后，用标本绳将标本夹扎紧，或用石块压将标本夹放在通风处，总之，标本干得愈快愈好，以便保持原有色泽。如遇到高温潮湿天气，标本在纸内容易发霉、变黑。在压制标本过程中，通常前四天，每天早晚各换一次纸，以后每天换一次，直至完全干燥为止。在第一、二次换纸时要对标本进行整形，因经初步干燥后，标本容易展平。换纸时，先将上面一层湿纸取下，然后放上一层干燥的纸，再将夹有一层标本、连同下面一层湿纸一同翻转到另一标本夹上，取下湿纸，以此类推。

幼嫩多汁的标本，如花及幼苗等，可夹在脱脂棉中压制；含水量高的可置30～45℃的烘干箱内烘干。

2.封套标本的制作

干燥后的标本，可制作封套标本，按种类进行分装，连同采集记载一同放入牛皮纸袋中或用厚的绘图纸折成的长方形纸套中，也可存放在普通纸盒中保存。把鉴定记载贴在纸袋上，然后按寄主或菌类分类排列存放，以便教学和研究用。

3.盒装标本的制作

供长期保存或展览用时，可装于标本盒内制成盒装标本。标本盒一般为34cm×27cm或28cm×20cm玻璃面。每盒内只装一种标本，可用乳白胶或透明胶布固定，也可在盒内铺上一层脱脂棉，将标本展布在棉花上。有的病原体用脱脂棉代替棉花也可装入小瓶中，放置在纸盒内适当位置，然后加上标签保存。

4.台纸标本的制作

干燥后的标本还可用透明胶或胶水将标本固定在台纸上，如果是幼苗病株还可以用针线缝在台纸上。台纸为较厚的白纸板，大小为37 cm×29cm。粘贴时，标本应放在台纸适宜的位置，在台纸左下角或右下角贴标签，上面再覆盖一层玻璃纸，以防擦伤或落灰尘。注意：蜡叶标本易遭虫蛀或霉变，可用1∶1000倍的升汞酒精溶液涂抹，也可将小包樟脑粉置于标本袋或标本盒中，每年用磷化铅熏蒸（30g/m³）1～2次更好。在贮藏中要保持干燥，有的标本柜下可放石灰吸潮。

5.浸渍标本的制作

柔软多汁的块茎、块根、果实及肉质的菌类子实体必须用防腐性浸渍液保存。常根据浸制标本的色泽和浸制的目的选择浸渍液的配方。

（1）普通防腐性浸渍液常用于防腐，而不保持原色，宜保存肉质鳞茎、块根、果实等。浸渍时应将标本洗净，浸泡在浸渍液中，使浸渍液淹没标本，用线将标本固定在玻片或玻棒上防止标本上浮，若浸泡标本量大，浸泡数日后应更换一次浸渍液。加盖密封保存，标本瓶上贴上标签。浸渍液有：①福尔马林50ml＋95％酒精300ml＋水2000ml；②70％酒精；③5％福尔马林。

（2）绿色标本浸渍液①醋酸铜溶液适用于能加热的标本，如茎叶等。将50％的醋酸放入烧杯（1000ml）或瓷盆（直径40 cm）内加热，再将结晶的醋酸铜逐量加到50％的醋酸中，直到不再溶解为止（大约1000ml的50％的醋酸加入15g醋酸铜）。将饱和溶液稀释3～4倍加热至沸腾，再将洗净的标本投入，当标本褪绿，又经3～4min恢复绿色后，取出标本，用清水洗净，压成干制标本或保存在5％福尔马林液中。

②硫酸铜及亚硫酸浸渍液适用于不能煮沸的水果或块茎、块根类等。将标本洗净浸在5％的硫酸铜溶液中6～24h，取出后用清水漂洗数小时，然后将标本保存在亚硫酸溶液中（用含5～6％二氧化硫的亚硫酸溶液15ml＋水1000ml，也可用浓硫酸20ml＋水1000ml＋亚硫酸钠16g）。

注意：醋酸铜溶液保持绿色能力较好，适用于能煮沸的标本，但保存的标本有时带蓝色，与植物原来的颜色稍有差异。硫酸铜亚硫酸浸渍液适合浸渍棉铃、葡萄和番茄等不能煮的果实标本。

（三）植物病害标本的保存

标本的浸渍液因由具有挥发性或易于氧化的药品配成，要长期保持浸渍效果，必须密封瓶口。封口有永久封口法和临时封口法两种。

1.永久封口法

可用酪胶及消石灰各一份混合，然后加水调成糊状，即可使用。

2.临时封口法

可用蜂蜡及松香各一份，分别熔化，然后混合，并加入少量凡士林调成胶状物即可。

3.注意事项

①采集植物病害标本时，一定要把病害和虫害区分开，如蚜虫、螨类等刺吸口器害虫为害植物均造成叶片褪绿变黄，没有病理过程，采集时一定要看叶片背面是否有害虫。采集病叶时要采集叶片完整的标本。

②每种标本采集的件数不能太少，一般叶斑类病害标本，至少要采十几片病叶。禾谷类植物病害标本要随采随压制，叶片多的或叶片太长的可取其中的一部分叶片或叶片的一部分压制。

③如采集腐败的果实、黑粉病类标本等要放在纸袋内或用纸包好，单独存放，避免孢子混杂而影响鉴定。

④采集柔软肉质的果实类标本，要分别用纸包好，并用采集箱存放，以免损坏和沾污。标本务求完整，采集时应特别注意。

⑤木质化枝条类的标本，采集比较方便，可用刀或锯取其一部分。

⑥制作绿色浸渍标本时，因要加热，注意用电安全或防止烫伤。

⑦在标本保存的过程中，要经常检查标本是否被虫蛀、发霉或浸渍液蒸发减少，要及时处理，注意除虫、防霉、更换浸渍液。

（四）玻片标本的制作

对于植物病害的病原物，一般采用制片的方法观察和保存。对生长在植物表面的病原物，可直接用挑针或刮刀挑取少许放在载玻片上的水滴或其他浮载剂上，加盖玻片即可进行观察。对植物组织内部的病原物，可将选好的材料用刀片切成薄片，或先将材料夹在胡萝卜、马铃薯内，再切成薄片，用毛笔蘸水轻轻取下，放在有水的浅皿中，选其中最薄的制片观察或短期保存。

三、显微玻片标本的制作方法

观赏植物、蔬菜病理显微玻片标本的制作是植物病理显微技术中最基本的操作技术，也是植物病理实验室的基本技术之一。在显微镜观察中，玻片标本的质量直接影响观察效果。

（一）浮载剂的选择

观赏植物、蔬菜病理玻片标本制作过程中，浮载剂的选择是很重要的。浮载剂是显微镜观察过程中必备的物品，其功用是防止材料的干燥变形和光线的扩散。在植物病理试验中常用的浮载剂有下列几种：

1.水

即蒸馏水(或洁净的凉开水)是最常用的浮载剂之一，其优点是取材容易，简便易做；缺点是容易蒸发干燥，形成气泡，只适用于临时检查，不能做较长时间的保存。

2.乳酚油

亦是常用的浮载剂，它的优点是不易干燥，可保存一定时期，并兼有透明防腐作用，缺点是易滑动，不易封固，还有使孢子膨大的作用，不能用作测量孢子的大小。其配制方法如下：

乳酸　　　　　　20ml

甘油　　　　　　40ml

石炭酸(苯酚)　　20ml

蒸馏水　　　　　20ml

将以上四种物品混合即成。若在乳酚油中加入0.05％～0.1％棉兰或0.1g酸性复红,即成乳酚油染剂,可使原生质染色。此染液在下述情况下使用：

（1）病原菌无色，为使观察更加清晰。

（2）病原菌过小,在显微镜下不易观察,染色后利于观察。

（3）病原菌的营养体或孢子有无隔膜不清晰,经染色后,由于原生质着色而衬托出细胞壁来,便于观察。

3.甘油明胶

它的用途很广，可作永久切片，既可作黏着剂又是浮载剂。其配制方法如下：

明胶　　　　　　　5g

甘油　　　　　　　35g

石炭酸(苯酚)　　　0.7g

蒸馏水　　　　　　30g

先将明胶放在蒸馏水中浸透，用水加热熔化，待明胶熔化后，加入甘油和苯酚，并搅匀，用纱布过滤。储于瓶中。过滤应在70～80℃水液中进行，温度不能过高，以免发生气泡。在夏季高温时，甘油明胶为液态，可直接作浮载剂；冬季低温时，先将贮存甘油明胶的滴瓶放入70℃温水中待甘油明胶熔化后使用。

在制片时，先把挑好的切片材料放在玻片中央，然后取甘油明胶一小团(或一小滴)放在材料上，将盖玻片斜倚在明胶团上，在酒精灯火焰上将玻片微微加热到胶团熔化，盖玻片自动倒伏盖即成。

用甘油明胶封固的标本，可保存较长时期，但在冷湿条件下易吸水而被破坏，因此，制好的玻片标本一般要平置十几天，待干燥后，盖玻片四周用加拿大树胶封固。

（二）显微玻片标本的制作方法

观赏植物、蔬菜病理的显微玻片标本的制作，根据材料和目的不同，可以采用不同的方法来制片。最常用的有挑、切、刮和涂四种方法。

1.“挑”

一般对在病组织上长有茂密霉状病原体的标本，常用“挑”的方法制片。取黄瓜霜霉病(病叶)或云杉锈病病叶上挑取白霉状或铁锈色粉状物制片观察,其具体步骤如下:

（1）首先擦净盖、载玻片，在载玻片中央滴一滴浮载剂；

（2）用扩大镜观察病害标本，找出适于挑取病原物；

（3）把挑针在浮载剂中沾湿，然后轻轻挑取病原物，放于载玻片中央的浮载剂中，若病原物纠集在一起，可用两支挑针轻轻拨开；

（4）将盖玻片一侧先接触浮载剂，后轻轻放平，置显微镜下观察；注意孢子囊梗和孢子囊或夏孢子和冬孢子的形态特征。

2.“刮”

对病原物在病组织上比较稀少甚至用扩大镜也分辨不清的标本，不宜采用挑的方法，应用“三角”挑针(将普通钢针尖放在酒精火焰上烧红,用小锤敲扁即成)刮取病原物制片。即将挑针尖端放入浮载剂中沾湿，取番茄早疫病、白菜黑斑病或茄子园星病病害标本，用挑针沿同一方向刮取2～3次,将刮得的病物放入载玻片上的浮载剂中,按上法盖上盖玻片即成。在此值得注意的是：载、盖玻片尤要洁净，浮载剂应尽可能少加，否则少量的病原物在较多浮载剂中盖上盖玻片后易向四周溢出，镜检时难以寻找。

对病原物在蔬菜寄主上生长较牢固的或病原物短小不易挑取的材料，也宜采用“刮”的方法。

3.“切”

切的方法很多，此处只介绍徒手切片法：就是用刀片或剃刀片，把组织切成极薄的薄片，主要用于着生于寄主组织内部的病原物，或观察病原物在寄主组织着生方式及病组织的病变。

取病害标本，在病组织上选子实体密集的部位，用少许水湿润一下，用刀片取3～5mm见方的材料，放在方木板或载玻片上，以左手食指轻轻压住材料，拇指和中指固定木板或玻片；以右手拇指和食指握住刀片偏前部，使刀片与材料剖面平行，自左向右拉切，以左手前推或后拉调节厚度，将材料切成薄片，切下的薄片放入表面皿水中，应稍加选择去粗取薄，用挑针挑到玻片上制片观察。此外对柔软的病组织可将材料夹在木髓或新鲜马铃薯或胡萝卜块中间，用剃刀或刀片切，切时应注意将刀口由外向内，由左向右移动，切下的组织多黏着在刀片上，可用毛笔轻轻移下或直接放入表面皿或培养皿中的水中，用挑针选取适宜的材料制片观察。

徒手切片是观赏植物、蔬菜病理学研究中一项基本的操作技术，应反复练习，熟练掌握。

4.涂片

涂片常用于病原细菌的观察，涂片后经染色再镜检，涂片所用的载玻片必须用去污粉和水充分擦洗，以除去油脂后保存在75％酒精中备用，涂片染色方法如下：

（1）涂片取洁净的载玻片，将其一面在火焰上微微加热，除去酒精、油脂等，冷却后，在中央加一小滴蒸馏水；用接种环按无菌操作手续，取出少许菌种，与玻片上的蒸馏水混合后，涂布均匀，涂布面不宜过大。

（2）干燥将涂片在空气中自然干燥。

（3）固定将已干燥的玻片涂面向上，在酒精灯上通过2～3次，以杀死细菌，使蛋白质凝固，将细菌固定在玻片上。

（4）染色将染色剂(石炭酸复红或结晶紫液)滴在涂片面上,使其布满整个涂面,保持1分钟。

（5）冲洗用手持玻片，使其倾斜，用洗瓶或自来水龙头下清水轻轻冲洗，除去多余染液，至流水变清为止。

（6）吸干用吸水纸轻轻吸去载玻片上的水分，但要注意勿将细菌擦掉。

（7）镜检先用低倍镜调好光源，把要观察的部位放在视野中央，再换油镜。