细菌病的实验室诊断方法

第六节　 细菌病的实验室诊断方法

细菌性传染病，除少数如破伤风等可根据流行病学、临床症状作出诊断外，多数的临床特点只能作为初步诊断的依据，确诊则需要在此基础上进行一系列实验室诊断，以确定病原是否为细菌以及病原菌的类型或检出特异性抗体。常用的诊断方法包括细菌的形态检查、分离培养、生化试验、血清学试验、动物接种试验、分子生物学检测方法等。细菌病的实验室诊断需要建立在正确采集病料的基础上。

一、病料的采集、保存及运送

（一）病料的采集

1.采集病料的原则。

（1）无菌采样：病料的采集尽量进行无菌操作，所用器械、容器及其他物品均需事先灭菌。同时在采集病料时也要防止病原菌污染环境及造成人的感染。剖检场地应选择易于消毒、不渗水的地面或台面，最好有专门的剖检场所和剖检台。剖检前，动物尸体应在消毒液中浸泡消毒，打开胸腹腔后，应先取病料以备细菌学检验，然后再进行病理学检查。最后将剖检的尸体焚烧，或浸入消毒液中过夜，次日取出作深埋处理。剖检后的用具及场地都要进行消毒或灭菌处理。在整个采样过程中，应注意做好个人防护。

（2）适时采样：病料一般采集于濒死或刚刚死亡的动物，最好不超过6h，否则时间过长，肠内细菌扩散入其他脏器，影响检测结果。所取病料应立即送检。如不能立刻进行检验，应存放于低温中。若需要采集血清样品，最好采发病初期和恢复期两个时期的血清。

（3）适当部位：根据疾病的类型和表现采集病变最典型的部位。呼吸道感染可采集鼻、咽拭子和痰液、肺组织，如鸡传染性鼻炎病例会出现鼻炎、眼结膜炎、眶下窦炎，可采集其鼻腔内容物；消化道感染可采集呕吐物、粪便，如对疑似仔猪黄白痢的病例应采集其小肠前段黏膜刮取物；全身败血症疾病应采集血液、实质器官，如对出现心包炎、肝周炎的疑似大肠杆菌感染的病死鸡可采集其心血、肝脏等；神经系统疾病宜采集脑脊液、脑组织；创伤感染采集深部伤口炎性组织或渗出物等。一般不采集使用过抗生素的病料，必须采集的应标明抗生素的种类，以便于实验室检查时采取适当措施进行处理。

（4）采样适量：采集的病料不宜过少，以免在送检过程中细菌因干燥而死亡。病料的量至少是检测量的4倍。

（5）做好标记：应详细填写与疾病发生相关的有临床诊断价值的资料。

2.采集病料的方法。

（1）液体材料：鼻腔分泌物、咽部黏液、痰液、脓汁、胸腹水等，一般用灭菌的棉拭子蘸取或用吸管吸取放入无菌试管内，密封。全血样品可无菌操作从静脉或心脏采血，然后放入含有无菌抗凝剂的灭菌试管中混合均匀。若需分离血清，则采血后不加抗凝剂，直接放在灭菌的试管中，摆成斜面，待血液凝固析出血清后，再将血清吸出。方便时可直接无菌操作取液体涂片或接种适宜的培养基。比如鸭疫里氏杆菌所致的鸭出血性浆膜炎有时可见腹腔积液，可采集其腹腔液、血液进行检测。

（2）实质脏器：应在解剖尸体后立即采集。若剖检过程中被检器官被污染或剖开胸腹腔时间过久，应先用烧红的铁片烧烙表面，或用火焰灭菌后，在烧烙的深部取一块实质脏器，放在灭菌试管或平皿内。如剖检现场有细菌检验条件，可在剖检后直接做病料的触片染色和细菌的分离培养。比如猪丹毒杆菌所致的急性猪丹毒为败血症经过，脾脏、肾脏、淋巴结肿大，可采集其实质脏器进行检测。

（3）肠道及其内容物：肠道采集只需选择病变最明显的部分，将其中内容物去掉，用灭菌水轻轻冲洗后放入平皿内。粪便应采取新鲜的带有脓、血、黏液的部分，液态粪便应采集絮状物。有时可将胃肠两端扎好剪下，保存送检。比如对大肠杆菌所致的仔猪腹泻病例可采集小肠前段黏膜刮取物进行检测。

（4）皮肤及羽毛：皮肤采集要取病变明显且带有一部分正常皮肤的部位。被毛或羽毛要取病变明显部位，并带毛根，放入灭菌平皿内。猪发生葡萄球菌感染会出现渗出性皮炎和坏死性皮炎，皮肤型链球菌感染常在鼻梁部、腿部关节、腹侧皮下等部位出现脓肿，检测均需采集皮肤样本。

（5）胎儿：可将流产胎儿及胎盘、羊水等送往实验室，也可用吸管或注射器吸取胎儿胃内容物放入试管送检。比如布氏杆菌病常引起动物流产，可采集流产胎儿的胃内容物、肺、肝、脾等进行检测。

（6）脑、脊髓：可将脑、脊髓浸入50％的甘油盐水中，或将动物整个头部割下，用浸过0.1％氯化汞溶液的纱布或油布包裹，装入木箱送检。比如鸭疫里氏杆菌感染的病鸭常有神经症状，可采集其整个鸭头送检。

（二）病料的保存与运送

采集的病料应遵循低温保存、尽快送检的原则。如立即检测，可冷藏保存。如不能立即检测，最好加入适当保护剂（液体石蜡或50％甘油缓冲盐水），在-20℃或-70℃冻存，并避免反复冻融。

供细菌学检验的病料，最好由专人送检，并附病料送检单，内容包括送检单位、地址、动物品种、性别、日龄、送检的病料种类和数量、检验目的、保存方法、死亡日期、送检日期、送检者姓名，并附临床病例摘要（发病时间、死亡情况、临床表现、免疫和用药情况等）。病料包装容器要牢固。对于危险材料、怕热或怕冻的材料要分别采取措施。

二、实验室检查

（一）细菌的形态检查

细菌的形状、大小、排列、染色特性、有无特殊结构等是形态检查的主要内容。细菌形态检查包括病料中细菌的直接涂片检查和细菌人工培养后的形态观察，前者有助于对细菌的初步认识，也是决定是否进行细菌分离培养的重要依据，有些形态较为典型的病原菌如炭疽杆菌、葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌等通过病料组织触片、染色、镜检即可确诊。后者是在细菌分离培养后，将细菌培养物涂片染色，观察细菌的形态、排列及染色特性，这是鉴定分离菌的基本方法之一，也是进一步进行生化试验和血清学鉴定的前提。

常用的染色方法包括单染色法和复染色法，应用时应根据实际情况选择适当的染色方法。对病料中的细菌进行检查，常选择单染色法，如美蓝染色法或瑞氏染色法；对培养物中的细菌进行染色检查时，多采用可以鉴别细菌的复染色法，如革兰染色法等。不染色标本主要用于细菌动力的检查。

在对病料直接进行细菌的形态检查中，有时可以观察到细菌，有时可能观察不到。如病原菌因毒力强，在体内很少量就可以致动物死亡；或所取病料含菌量少，在这些情况下观察不到细菌是正常的。所以，直接镜检观察到目的菌，可为进一步的鉴定提供依据；若没有观察到目的菌，也不能完全排除细菌病的可能，还需要依靠临床资料，如流行病学、临床表现及病理变化等进行综合判定，对所怀疑的某种细菌进行分离培养，以便进一步从其他方面鉴定确诊。

（二）细菌的分离培养

细菌的分离培养是将混杂在病料中的目的菌与杂菌通过在平板培养基表面划线接种的方法分离开，经培养得到细菌菌落。不同细菌在一定培养基中有其特定的生长现象，如在液体培养基中出现均匀混浊、沉淀、菌环或菌膜等；在固体培养基上形成的菌落形状、大小、色泽、气味、透明度、黏稠度、边缘结构和有无溶血现象等，均因细菌的种类不同而异。根据菌落特征，可初步确定细菌的种类。但对多数细菌，需进一步获得纯培养及接种特殊培养基进行生化试验或确定其抗原性与致病力等。

（三）细菌的生化试验

将单个菌落转接于斜面培养基或液体培养基中培养，获得细菌的纯培养。只有经过纯培养的细菌才能用于生化试验鉴定。生化试验可对所鉴定的细菌可能归属的几个科属进行鉴别，尤其对革兰染色反应、菌体形态以及菌落特征相同或相似的细菌的鉴别具有重要意义。吲哚试验、甲基红试验、V-P试验和枸橼酸盐利用试验等常用于鉴定肠道杆菌，合称为IMViC试验。例如，大肠杆菌对这4种试验的结果是＋＋－－，而产气杆菌则为－－＋＋。在生化试验中，先选择对科或属有重要鉴定意义的生化试验，在确定了科或属的前提下，再进行属内种的鉴别。目前一般采用商品化的试剂盒进行细菌的生化试验。

（四）动物试验

动物试验常用于证实所分离菌是否有致病性或对细菌进行纯化，有时也用于增强细菌的毒力。进行动物试验，最常用的是本体动物接种和实验动物接种。实验动物应力求标准化，同时注意动物保护。

（五）菌体抗原成分及代谢产物的检测与分析

对于性状非常相似的细菌，利用一般的生化方法很难区别，而根据菌体特有的抗原成分，通过免疫学方法检测，可作为鉴定依据。利用此方法可进行菌种或菌型的确定。其中最简单和常用的方法是玻片凝集反应。此外，还有多种检测抗原的敏感方法，如对流免疫电泳、放射免疫测定、酶标记抗体技术等。另外，气相色谱等技术还可以测定细菌的组分或代谢产物。

（六）毒素检测

细菌毒素既是细菌特有的物质，也是细菌毒力因子的重要指标。在微生物学检查中，主要测定细菌的外毒素。在测定毒素前，对稀释样本或培养物，通过离心去除菌体。检测时，首先测定对实验动物的致病性，必要时通过抗毒素与毒素的中和试验，确定毒素的类型。

（七）细菌遗传物质的检测

通过检测细菌的遗传物质可直接对细菌进行鉴定，目前比较成熟的技术包括PCR技术和基因探针技术。常规的PCR技术可将检测时间缩短至1.5h左右，而通常细菌学检测需要d的时间。

1.PCR技术：根据病原体基因的保守位置设计特异引物，细菌标本经过简单裂解、变性后，暴露细菌核酸，加入特异性引物、核苷酸、DNA聚合酶及缓冲液，即可在PCR仪上进行扩增反应，经过25～35个循环，通过琼脂糖凝胶电泳即可观察扩增结果，检出病原体。这种技术的特点是简便、快速，尤其适用于一些生长缓慢（如结核分支杆菌、支原体等）和难于培养以及用药后不宜分离培养的细菌。

2.基因探针技术：用标记物标记细菌基因组或质粒DNA上的特异性片段制备成细菌探针，待检标本经一定处理后，可使细菌DNA固定于一固相表面，经裂解变性、预杂交和杂交后，DNA探针可与同源靶DNA发生特异性结合。利用探针上标记物发出的信号可以知道杂交结果并判断病原菌的性质。

（八）细菌的抗体检测

动物受病原菌感染后，经一定时间刺激产生抗体，且抗体滴度随感染过程延长而增高。因此，用已知细菌或其成分作为抗原，检测患病动物或康复动物体内的抗体水平，可辅助诊断细菌病。如在生产实践中常用凝集试验进行鸡白痢和布氏杆菌病的检疫。多数血清学试验的诊断需取患病初期和康复期双份血清，当后者抗体效价比前者升高4倍以上时方具有诊断意义。

【知识链接】

L型细菌：L型是指细菌发生细胞壁缺陷的变型。因其首次在英国Lister研究所发现而得名。当细菌细胞壁中的肽聚糖结构受到理化因素或生物因素的直接破坏或合成被抑制时就可以形成细胞壁缺陷菌株。这种细胞壁受损的细菌一般在普通环境中不能耐受菌体内部的高渗透压而胀裂死亡；但在高渗环境下仍可存活而成为遗传稳定的细胞壁缺陷型。G^＋菌L型必须生存于高渗环境中，G^－菌L型在低渗环境中仍有一定的抵抗力。

细菌L型呈高度多形性，有球状、杆状和丝状，大小不一，大多呈G^－染色特性。生长较缓慢，一般培养2～7d在软琼脂平板形成中央较厚、四周较薄的荷包蛋样细小菌落。在液体培养基中生长后呈较疏松的絮状颗粒，沉于管底，培养液则澄清。

人工诱导或自然情况下，细菌L型在体内或体外均能产生。细菌变为L型后其致病性有所减弱，但在一定条件下L型又可回复为细菌型，引起病情加重。细菌变为L型后因失去细胞壁而对某些抗生素不再敏感，常可导致临床药物治疗失败。另外，变形后的细菌其形态、培养特性均发生了改变，以致查不出病原而贻误诊治。临床遇有症状明显而标本常规细菌培养阴性者，应考虑细菌L型感染的可能性，宜做细菌L型的专门培养。

【案例分析】

某公司用蛭弧菌作为淡水和海水的环境改良剂，据称对引起虾蟹红体、红腿、肠炎、烂鳃等细菌性疾病的病原（嗜水气单胞菌、大肠杆菌、沙门菌、海洋弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、荧光假单胞菌等30多种细菌）有极强的裂解作用。试分析其机理。

蛭弧菌是一类以细菌为宿主的细菌，有鞭毛，比通常的细菌小，可通过细菌滤器。蛭弧菌可以通过鞭毛的运动攻击细菌细胞壁，进入革兰阴性细菌的周质间隙中繁殖，受到感染的宿主细胞也开始膨胀，并变为一个对渗透压不敏感的球形体。随着蛭弧菌的增殖和某些酶的产生，宿主细胞壁进一步瓦解，子代蛭弧菌释放出来。完成这一生活周期约需h。子代蛭弧菌遇到敏感宿主又可重新侵染，开始下一个循环。

由于周质间隙为革兰阴性菌所特有，所以蛭弧菌裂解这些菌的能力比对革兰阳性菌强。

【复习思考题】

1.试述细菌的基本结构、特殊结构及其功能。

2.比较G^＋菌和G^－菌细胞壁的结构及化学组成的差异有何实际意义。

3.细菌的生长繁殖需要哪些基本条件？细菌生长曲线的特点在实践中有何应用？

4.细菌生化反应的类型有哪些？

5.试述细菌常见的变异现象及变异机制。

6.试述细菌的命名方法和分类体系。

7.细菌病实验室诊断方法有哪些？