病毒病的微生物学诊断

第六节　病毒病的微生物学诊断

除少数病毒病如羊痘、羊口疮等可以从临床症状、流行病学、病理学等变化作出诊断外，大多数病毒病的诊断需在临床诊断的基础上进行实验室诊断，以确定病毒的存在或检出特异性抗体才能最终确诊。动物病毒病的微生物学诊断最经典的手段是分离与鉴定病毒，此外还包括病料的采集、接种与培养、形态学观察、理化特性测定、血清学与分子鉴定等基本过程。电子显微镜技术可以直接检测样本中的病毒颗粒，血凝试验用于检测具有血凝特性的病毒。常用的病毒的血清学检测方法有中和试验、血凝抑制试验、补体结合试验、免疫荧光抗体技术、免疫沉淀与免疫转印技术、酶联免疫吸附试验。病毒核酸的检测可直接提供病毒存在的证据，主要有PCR反应、核酸杂交、DNA芯片技术。

一、病毒的分离

病毒分离的一般程序：将检验标本用青链霉素进行杀菌处理后，接种易感动物、鸡胚或细胞进行增殖，结合动物的症状、鸡胚或细胞的病变，经微生物学方法、血清学方法或分子生物学方法鉴定病毒。

无菌标本（脑脊液、血液、血浆、血清）可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液、洗液洗涤后制成10％～20％悬液离心后，取上清液接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。

二、病毒的鉴定

（一）病毒在细胞内增殖的指征

1.细胞致病作用（CPE）：病毒在细胞内增殖引起细胞退行性变，表现为细胞皱缩、变圆、出现空泡、死亡和脱落。某些病毒产生特征性CPE，普通光学倒置显微镜下可观察上述细胞病变，结合临床表现可做出预测性诊断。免疫荧光抗体法用于鉴定病毒具有快速、特异的优点，细胞内的病毒或抗原可被荧光素标记的特异性抗体着色，在荧光显微镜下可见斑点状黄绿色荧光，根据所用抗体的特异性判断为何种病毒感染（彩图9）。

2.红细胞吸附现象：流感病毒和新城疫病毒感染细胞后24～48h，细胞膜上出现病毒的血凝素，能吸附豚鼠、鸡等动物及人的红细胞，发生红细胞吸附现象。若加入相应的抗血清，可中和病毒血凝素、抑制红细胞吸附现象的发生，称为红细胞吸附抑制试验。这一现象不仅可作为这类病毒增殖的指征，还可用于病毒的初步鉴定。

3.干扰现象：一种病毒感染细胞后可以干扰另一种病毒在该细胞中的增殖，这种现象叫干扰现象。干扰现象可在同种以及同株的病毒间发生，后者如流感病毒的自身干扰。异种病毒和无亲缘关系的病毒之间也可以互相干扰，且比较常见。

病毒间干扰的机制还不完全清楚，概括起来包括：病毒作用于宿主细胞，诱导产生干扰素。除干扰素外，还有其他因素也能干扰病毒的增殖，例如，第一种病毒占据或破坏了宿主细胞的表面受体或者改变了宿主细胞的代谢途径因而阻止另一种病毒的吸附或穿入，如副黏病毒等。另外，也可能是阻止第二种mRNA的转译，如脊髓灰质炎病毒干扰水泡性口炎病毒。还有可能是在复制过程中产生了缺陷性干扰颗粒（DIP），能干扰同种的正常病毒在细胞内复制，如流感病毒在鸡胚尿囊液中连续传代，则DIP逐渐增加而发生自身干扰。

（二）病毒感染性的定量测定

1.空斑形成单位（Plaque-forming unit,PFU）测定：这是一种测定病毒感染性比较准确的方法。将适当浓度的病毒悬液接种到生长单层细胞的细胞培养板或细胞培养瓶中，当病毒吸附于细胞上后，再在其上覆盖一层融化的半固体营养琼脂，待凝固后，孵育培养。当病毒在细胞内增殖后，每一个感染性病毒颗粒在单层细胞中产生一个局限性的感染细胞病灶，病灶逐渐扩大，若用中性红等活性染料着色，在红色的背景中显出没有着色的“空斑”，清楚可见。由于每个空斑由单个病毒颗粒复制形成，所以病毒悬液的滴度可以用每毫升空斑形成单位（PFU/mL）来表示。

2.半数致死量（LD₅₀）或半数组织培养感染量（TCID₅₀）的测定：本法可估计所含病毒的感染量。方法是测定病毒感染鸡胚，易感动物或组织培养后，引起50％发生死亡或病变的最小病毒量，即将病毒悬液作10倍连续稀释，接种于鸡胚、易感动物或组织培养中，经一定时间后，观察细胞或鸡胚病变，如绒毛尿囊膜上产生痘斑或尿囊液有血凝特性，或易感动物发病而死亡等，经统计学方法计算出50％致死量或50％组织细胞感染量，可获得比较准确的病毒感染性滴度。

（三）病毒形态与结构的观察

病毒悬液经高度浓缩和纯化后，借助磷钨酸负染及电子显微镜可直接观察到病毒颗粒，根据大小、形态可初步判断病毒属哪一科。

（四）病毒的分子生物学诊断

随着现代分子生物学技术的发展，越来越多的分子生物学方法用于病毒学的研究，用于分析病毒核酸组成、基因组结构特征、核酸序列同源性比较以及核酸片段生物学功能确定等。目前最常用病毒鉴定诊断的分子生物学技术主要有PCR反应和核酸探针杂交等。

（五）病毒的血清学鉴定

血清学反应是指相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。鉴定病毒时常用的血清学反应有：中和试验、血凝抑制试验、酶联免疫吸附试验、放射免疫试验、免疫荧光抗体技术、乳胶凝集试验、免疫电镜技术等。

中和试验是以测定病毒的感染力为基础，以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，来判定免疫血清中和病毒的能力。有些病毒具有凝集某种（些）动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集（HA）试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制（HI）试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体及其含量。常用于正黏病毒、副黏病毒及黄病毒等的辅助诊断、流行病学调查，也可用于鉴定病毒型与亚型。酶联免疫吸附试验（ELISA）已被广泛应用于多种病毒性疾病的诊断。在动物检疫方面，ELISA在猪传染性胃肠炎、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。补体结合试验为高度敏感的检测方法之一，尤其某些抗原抗体反应不能用沉淀反应或凝集反应观察时可以利用此法。

【知识链接】

一、PCR技术、核酸探针杂交以及DNA芯片技术

1.聚合酶链式反应（PCR）：PCR技术又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA、RNA检测的领域。PCR具有以下反应特点：

（1）特异性强：引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸遵循碱基配对原则。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。

（2）灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将pg量级的起始待测模板扩增到ug水平。能从100万个细胞中检出1个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个PFU；在细菌学中最小检出率为3个细菌。

（3）简便、快速：PCR反应采用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增仪上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4h完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，无放射性污染、易推广。

（4）对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。

2.核酸探针杂交：互补的核苷酸序列（DNA与DNA、DNA与RNA、RNA与RNA等）通过碱基配对形成非共价键，从而形成稳定的同源或异源双链分子的过程，称为核酸分子杂交技术，又称核酸探针杂交。其原理是核酸变性和复性理论，即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又可分为DNA印迹杂交（Southern杂交）和RNA印迹杂交（Northern杂交）。

（1）制备样品：首先需要从待检测组织样品提取DNA或RNA。DNA应先用限制性内切酶消化以产生特定长度的片段，然后通过凝胶电泳将消化产物按分子大小进行分离。一般来说DNA分子有其独特的限制性内切酶图谱，所以经酶切消化和电泳分离后可在凝胶上形成特定的区带。再将含有DNA片段的凝胶进行变性处理后，直接转印到支持膜上并使其牢固结合。这样检测片段在凝胶上的位置就直接反映在了转印膜上。RNA样品则可直接在变性条件下电泳分离，然后转印并交联固定。

（2）制备探针：探针是指一段能和待检测核酸分子依碱基配对原则而结合的核酸片段。它可以是一段DNA、RNA或合成的寡核苷酸。在核酸杂交实验中，探针需要被标记上可直接检测的元素或分子。这样，通过检测与转印膜上的核酸分子结合的探针分子，即可知道被检测的核酸片段在膜上的位置，也就是在电泳凝胶上的位置，也就知道了它的分子大小。

（3）杂交：首先要进行预杂交，即用非特异的核酸溶液封闭膜上的非特异性结合位点。由于转印在膜上的核酸分子已经是变性的分子，所以杂交过程中只需变性标记好的探针，再让探针与膜在特定的温度下反应，然后洗去未结合的探针分子即可。

（4）检测：检测的方法依标记探针的方法而异。用放射性同位素标记的探针需要用放射自显影来检测其在膜上的位置；而如果是用生物素等非同位素方法标记的探针则需要用相应的免疫组织化学的方法进行检测。

3.DNA芯片技术：DNA芯片技术实际上就是一种大规模集成的固相核酸杂交技术，是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量预先制备的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交。通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。根据芯片的制备方式可以将其分为两大类：原位合成芯片和DNA微集阵列。芯片上固定的探针除了DNA，也可以是cDNA、寡核苷酸或来自基因组的基因片段，且这些探针固化于芯片上形成基因探针阵列。因此，DNA芯片又被称为基因芯片、cDNA芯片、寡核苷酸阵列等。

作为新一代基因诊断技术，DNA芯片的突出特点在于快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等，与传统基因诊断技术相比，DNA芯片技术具有明显的优势：

（1）基因诊断的速度显著加快，一般可于30min内完成。若采用控制电场的方式，杂交时间可缩至1min甚至数秒钟。

（2）检测效率高，每次可同时检测上千个基因序列，使检测过程平行化。

（3）基因诊断的成本降低。

（4）芯片的自动化程度显著提高，通过显微加工技术，将核酸样品的分离、扩增、标记及杂交检测等过程显微安排在同一块芯片内部，构建成缩微芯片实验室。

（5）因为是全封闭，避免了交叉感染；且通过控制分子杂交的严谨度，使基因诊断的假阳性率、假阴性率显著降低。

DNA芯片技术在肿瘤基因表达谱差异研究、基因突变、基因测序、基因多态性分析、微生物筛选鉴定、遗传病产前诊断等方面应用广泛。如感染性疾病是由于病原微生物（病毒、细菌、支原体等）侵入机体而引起。目前已经获得了一些生物的全部基因序列，包括众多微生物的序列，且数量还在增长。因此，将一种或几种病原微生物的全部或部分特异的保守序列集成在一块芯片上，可快速、简便地检测出病原体，从而对疾病作出诊断及鉴别诊断。

二、噬菌体

噬菌体是寄生于细菌、支原体、螺旋体、放线菌以及蓝细菌的一类病毒。噬菌体分类的主要依据是噬菌体的形态和核酸性质，其遗传物质可以是DNA或RNA，且大多数已知的噬菌体为双股DNA。大多数噬菌体可分为以下几种形态类型：无尾的二十面体噬菌体及有尾的噬菌体，后者又分为长尾、短尾及肌尾三大类。

T4噬菌体属于肌尾噬菌体科，带有复杂可收缩尾部，是T偶数噬菌体的代表。T4噬菌体含有二十面体头部及一个管状尾。尾部由一个内径中空的尾髓及外面包裹的蛋白质尾鞘组成。在头部和尾部连接处的颈部还有一个颈圈结构，为六角形环，颈圈附有6根颈须。尾部末端附有尾板、尾钉和尾丝组成的复杂结构（图3-8）。

图3-8　T4噬菌体结构图

噬菌体具有严格的宿主特异性，可以通过蛋白质外壳上的配体与宿主菌表面的受体特异性结合，将其遗传物质注入宿主体内，然后借助宿主菌的代谢酶系统进行增殖，合成子代噬菌体，从而裂解宿主菌，导致宿主菌的死亡。在此原理基础上，噬菌体得以开发并应用于人和动物疾病的治疗，有希望作为抗生素的替代品用于临床。

噬菌体治疗具备如下特征：

1.噬菌体有非常强的自我复制能力：噬菌体的显著特点是呈指数增殖。在适宜条件下，在每个裂解周期内，每个噬菌体都可产生200个子代噬菌体。只要重复4次感染周期，一个噬菌体颗粒便能够使数十亿个细菌细胞致死。

2.噬菌体对宿主菌有很高的特异性：噬菌体以自身特定的配体与细菌表面的特定受体结合，引发细菌的感染与噬菌体的增殖。噬菌体一般只裂解相应的宿主细菌，而不裂解其他细菌。

3.噬菌体制剂的研发周期短：噬菌体在自然界无处不在，有细菌的地方就有噬菌体。以特定细菌为宿主菌，很易筛选出特异性裂解的噬菌体，只需几天或几周的时间就可能完成。

目前噬菌体制剂受到国内外的初步认可。2006年美国食品和药物管理局首次批准李氏杆菌的噬菌体用于肉类食品的添加剂，国内有针对仔猪黄白痢等肠道感染的噬菌体口服制剂出售。

【复习思考题】

1.病毒的形态有哪些及病毒颗粒的基本结构如何？画出模式图。

2.简述病毒增殖的过程。

3.举例说明病毒的培养方式。

4.简述病毒变异的类型及病毒基因重组的类型。

5.依据病毒的核酸类型，病毒可分为哪几种？

6.简述病毒病的常用微生物学检测方法。