血清学技术概述

第一节　血清学技术概述

抗原与相应抗体在体内和体外均能发生特异性结合反应，因抗体主要来自血清，故将在体外进行的抗原抗体反应称为血清学反应或免疫血清学技术。免疫血清学技术自19世纪建立以来，不断发展，尤其是近20余年来，各种新方法、新技术层出不穷，成为生物学科的各个研究领域、以及疾病诊断、治疗和预防实践中应用最为广泛的免疫学技术。

一、免疫血清学技术的类型

抗原与抗体在体外结合时，可因抗原的物理性状不同或参与反应的成分不同而出现各种反应，如凝集、沉淀等。根据抗原抗体反应性质不同可分为凝集试验、沉淀试验、补体结合试验以及中和试验。凝集试验又分为直接凝集试验和间接凝集试验；沉淀试验结合电泳技术产生了微量免疫电泳、对流免疫电泳、火箭免疫电泳等；此外，还有标记抗体技术，如荧光标记抗体、酶标抗体及放射性标记抗体。

二、免疫血清学技术的一般特点

（一）特异性与交叉性

一种抗体只能与相应的抗原结合而产生反应，这种现象称为血清学反应的特异性。血清学反应具有高度的特异性，如抗猪瘟病毒的抗体只能与猪瘟病毒结合，而不能与口蹄疫病毒结合。特异性的本质是由抗体分子的可变区和抗原分子上的抗原表位空间结构互补决定的。只有抗原表位的立体构型和抗体分子的立体构型吻合，才能发生反应。这是血清学试验用于分析各种抗原和进行疾病诊断的基础。

自然界的微生物以及较大分子的蛋白质抗原常含有多种抗原表位，若两种不同的抗原之间含有部分共同的抗原表位，则发生交叉反应，即血清学反应的交叉性。例如抗鼠伤寒沙门菌的血清能凝集肠炎沙门菌，反之亦然。

（二）亲和性与解离性

抗原和抗体的结合为弱能量的非共价键结合，其结合力决定于抗体的抗原结合位点和抗原表位之间形成的非共价键的数量、性质和距离，由此可分为高亲和力、中亲和力和低亲和力的抗体。抗原与抗体的结合是分子表面的结合，这一过程受物理、化学、热力学的因素所制约，结合的温度应在0℃～40℃，pH在4～9之间。如温度超过60℃或pH降到3以下时，则抗原抗体复合物又可重新解离。利用抗原抗体既能特异性地结合，又能在一定条件下重新分离这一特性，可进行免疫亲和层析，以制备免疫纯的抗原或抗体（图13-1）。

（三）高敏感性

抗原与抗体结合还具有高度敏感性的特点，不仅可定性，而且可以定量检测微量、极微量的抗原或抗体，其敏感度大大超过当前所应用的化学分析方法。血清学试验的敏感度因其种类而异，例如免疫扩散、免疫电泳的检测水平通常在毫克水平，而酶联免疫吸附试验则在纳克水平，放射免疫分析法与定量荧光分析均在皮克水平。

a.将病毒抗原X结合到固相载体上b.加入经X抗原免疫的动物血清c.洗涤除去未结合的抗体d.洗脱下抗X抗原的抗体

图13-1　亲合层析法纯化病毒特异性抗体

（四）带现象

抗原与抗体在适宜条件下就能发生结合反应。但对于常规的血清学反应，如凝集反应、沉淀反应、补体结合反应等，只有在抗原与抗体呈适当比例时，结合反应才出现凝集、沉淀等可见反应结果，并且在最适比例时，反应最明显。因抗原过多或抗体过多而出现抑制可见反应，无凝聚物或沉淀物形成的现象，称为带现象。通常以格子学说解释带现象，即大多数抗体为二价，而大多数抗原为多价，只有两者比例适当时，才能形成彼此连接的大的复合物，而抗原过多或抗体过多时，不能连接成可见的复合物。为了克服带现象，在进行血清学反应时，需将抗原和抗体作适当稀释，通常是固定一种成分而稀释另一种成分。

（五）抗原抗体反应的阶段性

血清学反应存在二阶段性，但其间无严格的界限。第一阶段为抗原与抗体的特异性结合阶段，反应快，几秒钟至几分钟即可，但无可见反应。第二阶段为抗原与抗体反应的可见阶段，受电解质、温度、pH等的影响，表现为凝集、沉淀、补体结合等反应，反应进行较慢，需几分钟、几十分钟或更长。第二阶段实际上是单一复合物凝聚形成大复合物的过程。

三、免疫血清学反应的影响因素

影响血清学反应的因素很多，除抗原和抗体本身的因素外，也受到环境因素的影响。

（一）电解质

特异性的抗原和抗体具有对应的极性基（羧基、氨基等），它们互相吸附后，其电荷和极性被中和因而失去亲水性，变为憎水系统。此时须有电解质的参与才能进一步使抗原抗体复合物表面失去电荷而互相凝聚、发生凝集或沉淀反应。无电解质参加，则不出现可见反应。故血清学反应一般用0.85％（人、畜）或8％～10％（禽）氯化钠盐水作稀释液，标记抗体技术中，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）作稀释液。但电解质的浓度不宜过高，否则会出现盐析现象。

（二）温度

在一定温度范围内，较高的温度可以加快抗原和抗体分子运动的速度，增加其碰撞机会，从而加速抗原抗体结合和反应现象的出现。将抗原、抗体充分混合后，37℃孵育或在室温下进行。有的抗原或抗体系统在低温长时间结合反应更充分，如有的补体结合反应在冰箱低温结合效果更好。过高的温度可导致已结合的抗原-抗体复合物发生解离，甚至导致蛋白质变性。

（三）酸碱度

血清学反应常用的pH为6～8，pH过高或过低，均可使抗原-抗体复合物重新解离。若pH降至抗原或抗体的等电点时，可引起非特异性的酸凝集，出现假阳性结果。

（四）振荡

适当的机械振荡能增加分子或颗粒间的相互碰撞，加速抗原抗体的结合反应，但强烈的振荡也可能使抗原抗体复合物解离。

（五）杂质和异物

反应介质中如有与反应无关的杂质、异物（如蛋白质、类脂质、多糖等物质）存在时，会抑制反应或引起非特异性反应，所以每批血清学试验都应设立阳性对照和阴性对照。