细菌的生化鉴定

实训四　细菌的生化鉴定

一、目的要求

掌握用细菌生化检测试剂盒进行细菌鉴定的方法。

二、仪器及材料

大肠杆菌、沙门菌；革兰阴性细菌检测试剂盒；试剂盒开发公司配套的数据库系统；接种环、酒精灯、温箱等。

试剂盒内含有20种生化管及一个氧化酶（OX）试纸条。生化管包括邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）、精氨酸（ADH）、赖氨酸（LDH）、鸟氨酸（ODC）、柠檬酸盐（CIT）、硫化氢（H2S）、脲酶（URE）、乳糖（LAC）、吲哚（IND）、VP、明胶（GEL）、葡萄糖（GLU）、甘露醇（MAN）、肌醇（INO）、山梨醇（SOR）、鼠李糖（RHA）、蔗糖（SAC）、蜜二糖（MEL）、苦杏仁甙（AMY）、阿拉伯糖（ARA）等。

另外，需要自备：无菌液体石蜡、0.85％NaCl、VP试剂、吲哚试剂。

三、方法与步骤

1.将生化试剂盒从2℃～8℃避光环境中取出，将生化管按顺序摆放于所用安瓿瓶架上。

2.使用接种环从预先准备好的营养琼脂平板上挑取适量菌苔于生理盐水中，混匀，制备菌悬液。

3.将安瓿瓶颈部使用砂轮划痕，掰开。

4.取出用避光纸保藏的氧化酶试纸条，于纸条一端加100uL 0.85％ NaCl，挑取待测菌单菌落涂抹于浸湿的纸条上，s内观察并记录结果。

5.向每支生化管中加入100uL 制备好的菌悬液。柠檬酸盐为固体斜面培养基，菌悬液需沿斜面加入。

6.吸取200～300uL 无菌液体石蜡覆盖ADH、LDH和ODC孔。

7.用封口膜将安瓿瓶密封。

8.37℃培养18～h，明胶生化管若在18～h为阴性，可继续再培养18～h，转入4℃冰箱min。

9.结果判定。

（1）VP试验：取出试剂盒，向VP管内滴加6滴VP 甲液和2滴VP 乙液，摇动混匀，37℃ min后取出，培养基变为红色表明为阳性反应。

（2）IND试验：滴加1～2滴吲哚试剂，摇动混匀，min内出现粉红色环表明为阳性反应。

（3）明胶试验：呈液态为阳性，固体为阴性。

（4）其他生化反应按彩图19进行判断。

10.编码。

（1）将细菌各项生化反应结果填入附赠的记录卡中（表1），依次每三项为一组，若这三项反应均为阳性，则分别记为1、2、4，若为阴性，则相应项记为0。将每组三项的数值相加，共七组，组成一个七位数。

表1　革兰阴性细菌鉴定系统记录卡

（2）将所得七位数输入数据库系统中即可查询结果，系统将对菌株归属的相对概率、T值和R值，对菌株的归属进行一定程度的鉴定。

注意事项：

（1）若某项生化反应结果较难判断，则按照阴性进行记录，但查询时，应在不定的生化反应前打钩。

（2）若有必要，可根据系统给出的信息进行补充试验。

四、知识链接

上述检测试剂可按下列方法自行配制：

1.吲哚试剂：对位二甲基氨基苯甲醛g，溶于mL无水乙醇后，徐徐加入浓盐酸mL，避光保存。

2.V-P试剂：甲液为5％的甲萘酚酒精溶液（α-萘酚g，无水乙醇mL）；乙液为40％的KOH溶液。甲液乙液分装棕色瓶中于4℃～10℃保存。