染色体组型分析

实验三　染色体组型分析

一、实验目的

（1）掌握染色体制片技术。

（2）了解和认识某一物种染色体组的基本组成和染色体形态特征。

（3）计算染色体组型有关数据。

二、实验原理

各种生物的染色体数目是恒定的。大多数高等动植物是二倍体（diploid），即每一个体细胞含有两组同样的染色体，用2n表示。其中与性别直接有关的染色体，即性染色体可以不成对。每个配子带有一组染色体，称为一个染色体组（genome）。两性配子结合后，具有两组染色体，成为二倍体的体细胞染色体组成。

染色体在复制以后，纵向并列的两个染色单体（chromatids）通过着丝粒（centromere）连在一起。着丝粒在染色体上的位置是固定的。由于着丝粒位置的不同，可以把染色体分成相等或不等的两臂（arms），分成中间着丝粒、亚中部着丝粒、亚端部着丝粒和端部着丝粒等形态染色体。此外，有的染色体还含有随体和次缢痕。所有这些染色体的特异性构成一个物种的染色体组型。染色体组型分析是细胞遗传学的基础，在现代分类与进化、染色体原位杂交等领域都具有重要的意义。

三、实验说明

（1）染色体组型也称核型（karyotype），是指把动物、植物、真菌等某一个体或某一分类群的体细胞内整套染色体显微摄影后再放大照片，按照染色体相对长度、臂比、染色体臂数等参数将所有染色体作系统排列，可代表一个物种的染色体特征。

（2）由于实验室用于分析的染色体标本的组织来源不同，制作方法各异，分析时所依据的标准及采用的手段不同，所以同一物种的染色体组型分析结果可能不完全一样。因此，组型分析只是对每一物种染色体特征的基本和粗略描述。需要测量并处理的数据包括：

臂比＝长臂／短臂

着丝粒指数＝短臂／该染色体长度

总染色体长度＝该细胞单倍体全部染色体长度（包括性染色体）之和

相对长度＝每一个染色体的长度／总长度（以百分值表示）

（3）染色体分类和臂数计算的标准。染色体分类一般采用Levan提出的标准，即按臂比（arm ratio＝长臂长度／短臂长度）将染色体分为四类：

计算染色体长度时，可以包括随体也可以不包括，但均要注明。

染色体臂数的计算有两种标准：一种标准是根据Matthey的建议，将中部、亚中部着丝粒染色体的臂数计为2，亚端部和端部着丝粒染色体的臂数计为1。如此计算的臂数常称为染色体基数或臂数（fundamental number or fundamen-tal arm number，NF）。另一标准是将中部、亚中部和亚端部着丝粒染色体的臂数计为2，仅仅把端部着丝粒染色体的臂数计为1，称作染色体臂数（chromo-some arm number，AN）。

（4）有丝分裂和减数分裂时期的细胞都可以得到染色体组型，只是体细胞和性细胞染色体数目有倍性的差异。植物多选取生长旺盛的根尖、茎尖、花药、愈伤组织等细胞制片。动物则除了直接取肾、肝、脊髓、鳃、胚胎、性腺等组织细胞制片以外，还可体外培养各组织细胞进行制片。

四、实验材料

蚕豆或洋葱根尖；细胞中期分裂相显微摄影后放大的照片或图片。

五、实验用具和试剂

1．仪器用具

显微镜，乙醇灯，载玻片，盖玻片，恒温水浴锅，温度计，烧杯，指管，镊子，解剖针，染色板，纱布，吸水纸。

2．药品试剂

Schiff试剂，1MHCl，冰乙酸，95％乙醇，70％乙醇，0．1％秋水仙碱。

3．试剂制备

卡诺氏固定液的制备同实验一。

Schiff试剂：将1g碱性品红加入200mL煮沸的蒸馏水中，再煮沸3～4 min，待溶液全部冷却到50℃时过滤，再等溶液冷到25℃以下时，加入30mL　1 M HCl和3g偏重亚硫酸钠，装进棕色瓶，塞上瓶塞，置于黑盒中48h，溶液呈无色或淡黄色即可。若有少许红色，可用活性炭（加1g）过滤，经过滤的溶液（或加入活性炭充分振荡）还是淡红色就不能用，需要重新配制。

偏重亚硫酸钠与1MHCl反应，放出SO₂，SO₂与碱性品红反应，生成碱性品红-亚硫酸溶液，为无色溶液。

六、实验步骤

1．材料准备

选取新鲜饱满的蚕豆种子，加少量热水（90℃左右）搅拌1～2min，然后倒入冷水，使水温至45℃～50℃，自然降至室温，放置过夜，使种子充分吸水膨胀后将水倒出，用蒸馏水清洗，捞出包在干净的双层湿纱布中置于25℃培养箱中，每天换水，待种子开始萌发时取出，使胚根外露出向下插入经水洗过的湿锯末中，锯末厚度3～5cm，保持温湿条件继续培养，当胚根长到1．5～2cm时用水洗净，用吸水纸尽量吸干种子及胚根上的水分，将长出胚根的蚕豆置于0．1％秋水仙素溶液（量以浸没其根尖为宜），保存在8℃培养箱中（这样处理可抑制和破坏纺锤丝的形成，促使染色体缩短和分散）。然后，用刀片或剪刀将上述处理的根尖剪下1cm左右，以卡诺固定液室温固定2～24h，固定液量为根尖材料体积的15倍以上。用95％乙醇冲洗根尖后置于70％乙醇中，放于0℃～4℃冰箱可保存1～2年。

2．染色体标本制备

植物多采用压片方法制备。这里仅介绍Feulgen反应染色制片方法。

从固定液中选取6～8个根尖放在盛有1MHCl的试管中，在60℃水浴中水解8min，用清水冲洗干净，取出将根尖向内放在凹孔染色板上（一个孔内，如图3．1所示），加入Schiff试剂，染色20min，根尖应呈深紫红色，用刀片或解剖针切取根尖1mm于载玻片上，将其分割成4～5小块，用针尖拨碎分散开，加1滴45％冰醋酸，加上盖玻片，复以吸水纸，用平稳力挤压出多余的醋酸，用拇指、中指和食指将盖片、载片固定在实验台边，后用橡皮头玻璃棒用力均匀地敲打盖片，使根尖细胞成一单层细胞（材料呈一片云雾状），进行镜检。

图3．1　在染色板上用Schiff试剂染色

3．染色体二倍数（2n）的确定

在高倍镜下选取50～100个分散良好，形态清晰，数目完整的分裂相。计数每个细胞的染色体数目，找出染色体数目的众数，并计算众数所占百分比，据此确定它的染色体倍数（2n）。

4．染色体观察与测量

在油镜下选取5～10个数目完整，分散良好，长度适当（正中期），着丝粒清楚，两条染色体适度分开，形态清晰的染色体分裂相进行显微数码拍照。（见图3．2）

图3．2　蚕豆根尖染色体中期分裂相

在照片上记录染色体形态测量数据。首先确认每条染色体的着丝粒位置，以此为界用毫米尺测量染色体的长臂和短臂长度，或用染色体自动分析仪测得，按上述标准计算分类每条染色体，计算出每条染色体的平均数、相对长度和标准误差，并参考众数，确定该物种的染色体分类组成。在高倍镜或油镜下还需注意观察染色体的其他形态特征，如有无异型染色体对、次缢痕、随体等。

5．染色体组型测量数据分析整理

6．同源配对

选取其中形态最好，最有代表性的一个分裂相照片，依次剪下各单个的染色体，按表型特征将全部染色体配同源对（或同源组）。配对的根据是随体的有无及大小，臂比是否相等，染色体长度是否相等。

7．同源对排列

将染色体全部的同源对（或同源组）按以下规则依次整齐排列：

①全部着丝点对齐在同一水平线上；

②短臂朝上长臂在下；

③按大小降序从左到右依次排队（等长的染色体，短臂长者排在前头）；

④具随体染色体、性染色体排放在最后（蚕豆染色体组型例外）；若有两对以上具随体染色体，则大随体染色体在前，小随体染色体在后。

8．拍照

将排好的染色体对（组）按先后顺序粘贴在绘图纸上，编上序号；然后翻拍定型，使其成为终定的核型照片。

9．画出标准化模式图

用坐标纸或绘图纸绘成染色体模式图。

六、思考题和作业

（1）什么是染色体组型？主要包括那些内容？

（2）你认为研究某物种染色体组型分析的关键是什么。

（3）蚕豆染色体组型分析结果——数据统计表，核型图。

七、参考图示

图3．3　染色体模式图

图3．4　细胞有丝分裂中期分裂相（左，洋葱根尖；右，蚕豆根尖）