植物多倍体的诱发

实验四　植物多倍体的诱发

一、实验目的

（1）了解人工诱导多倍体的原理。

（2）学习用秋水仙素诱发多倍体植物的方法。

（3）学习识别多倍体植物的形态特征及其细胞学特点。

二、实验原理

生物体的细胞核中都有相对稳定的染色体数目，这是物种的基本特征之一。如太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）的体细胞具有20条染色体，人类则具有46条染色体，但是这些细胞核内的染色体并不是杂乱无序的，而是组成一个或多个染色体组（genome），或称基因组。在同一染色体组内所有的染色体在形态上以及染色体上携带的基因都不相同，但是它们包含了这一物种最基本的全套遗传物质，并以完整而协调的方式发生作用，构成了完整、协调的基因体系。在进化过程中由于选择压力的影响，这些基因以其平衡、协调的方式与环境相互作用，缺乏染色体组中的任何成分将面临淘汰的危险。

每个染色体组所包含的染色体数目称为基数（basic number），通常以X表示。例如，玉米的20条染色体包含了2个染色体组，X＝10。两组染色体之间有成对的同源染色体（homologous chromosome），在减数分裂过程中，每对同源染色体独自分到2个子细胞中，因此配子细胞只含有体细胞中2组染色体中的一组。单倍体（haploid）是指其细胞核内所含的染色体数与该物种配子中所含的染色体数目一样。就个体发育而言，生物体生殖细胞是单倍的，但是由于产生配子的生物体的倍性水平不同，配子可以是一倍的也可以是非一倍的。

植物多倍体是指每个细胞中的染色体数具有三整套或更多套数的植物。多倍体普遍存在于植物界，目前已知道被子植物中有1／3或更多是多倍体。

人工诱导多倍体的方法也很多，分为物理方法（温度剧变、机械损伤、各种射线处理等），化学方法（萘嵌戊烷、麻醉剂、富民农、植物生长激素等），其中秋水仙素是诱发植物多倍体的最有效的方法之一。秋水仙素是从百合科植物秋水仙的种子及器官中提炼出来的一种生物碱，又称秋水仙碱，毒性极强，分子式为C22H25NO6，一般是呈淡黄色的粉素，有苦味，易溶于冷水、乙醇、氯仿和甲醛，不易溶于乙醚和苯。它的作用在于阻止分裂细胞形成纺锤丝，染色体不向两极移动，而停止在细胞分裂中期，从而产生染色体加倍的核。若染色体加倍的细胞继续分裂，就形成多倍性的组织，进而产生多倍性的植物。它对染色体结构和复制无显著影响；浓度合适时，对细胞毒害不大。

三、实验材料

大蒜（2n＝16）、洋葱（2n＝16）、蚕豆（2n＝12）等作物的种子、根尖、花蕾或幼苗。

四、实验用具和试剂

1．仪器用具

显微镜，乙醇灯，培养皿，载玻片，盐酸，水浴锅，盖玻片，刀片，解剖针，吸水纸，铅笔等。

2．药品试剂

秋水仙素，醋酸洋红染液，卡诺氏固定液，Schiff试剂，无水乙醇，45％冰醋酸，1M盐酸。

五、实验步骤

（1）洋葱的处理：将搪瓷盘的盘口用线绳编织成许多网格，在盘内注入清水。把洋葱的鳞茎洗干净，用刀片将鳞茎上的老根削除，再把其放在搪瓷盘的网格上，使其生根部位恰好接触到水面，在25℃下培养数日。等新长出的不定根长1．5～2mm时，把制备好的秋水仙素溶液分装到3～5个培养皿中，每一培养皿放一洋葱鳞茎，处理浓度以0．01％～0．4％为宜，使其生根部位刚好和液面接触。同时，另选3～5个培养皿放清水，亦放洋葱鳞茎作对照。在25℃下培养数日后，处理液中培养的根尖明显比对照根尖肥大，此时便可用解剖剪将根尖取下，长度为1．5cm左右，放入固定液中固定24h。然后可按照常规的压片法进行细胞学制片，用显微镜观察并计数。

也可以采用种子浸渍法。处理种子时，可先在—定浓度秋水仙素溶液中浸种24h左右，在铺有滤纸的器皿上浸渍种子。再注入0．1％～0．025％浓度的秋水仙素溶液，为避免蒸发宜加盖并置于暗处，放入20℃培养箱中，保持适宜的发芽温度，干燥种子处理的天数应比浸种多1d左右。一般发芽种子处理数小时至3d或多至10d左右。对于种皮厚发芽慢的种子，应先催芽后再行处理。已发芽的种子用较低的浓度处理较短的时间，秋水仙素能阻碍根系的发育，因而最好能在发根以前处理完毕。处理后用清水冲洗，移栽于盆钵或田间。所诱导种子长成的植株为多倍体植株。

蚕豆根尖端处理时，秋水仙素浓度比洋葱根尖高，在1％以上。

（2）取下已膨大的根尖或幼芽，水洗后进行常规制片（卡诺固定液固定，70％乙醇保存，水洗，酸解，水洗，制片，Schiff试剂染色，压片等过程。参看实验三）。

或将膨大的根尖放入盛有醋酸洋红（5mL）的小试管中烧沸。稍离火，再烧沸，重复7～8次，即可做压片。

（3）观察中期细胞的染色体数目、形态，与二倍体细胞分裂相进行比较和统计（图4．1）。

图4．1　洋葱根尖细胞中期分裂相（左，2n；右，4n）

图4．2　大蒜根尖细胞中期分裂相（左，2n＝16；右，4n）

六、注意事项

（1）秋水仙素的处理时间应根据所提供的实验材料的细胞周期而定，当处理时间介于供试材料细胞周期的一倍到两倍之间时，可观察到细胞由二倍体变为四倍体；当处理时间为供试材料细胞周期的两倍以上时，供试材料的细胞可从四倍体变为八倍体，因此，在培养多倍体细胞时，应注意秋水仙素的处理时间。此外，秋水仙素的浓度对细胞分裂相也有影响，应注意掌握。

（2）秋水仙素为剧毒药品，实验中应注意不要将药品沾到皮肤上或眼中。如果沾到皮肤上，应用大量自来水冲洗。

七、作业

（1）简述秋水仙素诱导多倍体的原理。

（2）简述秋水仙素的处理时间与加倍效果的关系。

（3）设计实验以确定不同实验材料（蚕豆、洋葱等）的分裂高峰期时间特点。

（4）绘制四倍体及二倍体细胞分裂中期图像。

八、参考图

图4．3　大蒜根尖细胞染色体分裂相