果蝇的唾腺染色体

实验十　果蝇的唾腺染色体

一、实验目的

（1）学习剖离果蝇幼虫唾腺和压制唾腺染色体标本的方法。

（2）观察唾腺细胞的巨大染色体。

二、实验原理

20世纪初，Kostoff用压片法首先在Drosophila melanogaster果蝇幼虫的唾腺细胞核中发现了特别巨大的染色体——唾腺染色体（salivary gland chro-mosome）。事实上，双翅目昆虫（如摇蚊、果蝇等）的幼虫都具有很大的唾腺细胞，其中的染色体就是巨大的唾腺染色体。这些巨大的唾腺染色体具有许多重要特征，为遗传学研究的许多方面，如染色体结构、化学组成、基因差别表达等提供了独特的研究材料。

双翅目昆虫的整个消化道细胞发育到一定阶段之后就不再进行有丝分裂，而停止在分裂间期。但随着幼虫整体器官以及这些细胞本身体积的增大，细胞核中的染色体，尤其是唾腺染色体仍不断地进行自我复制而不分开，经过许多次的复制形成1000～4000拷贝的染色体丝，合起来达5μm宽，400μm长，比普通中期相染色体大得多（100～150倍），所以又称为多线染色体（polytene chromosome）和巨大染色体（giant chromosome）。

唾腺染色体形成的最初，其同源染色体即处于紧密配对状态，这种状态称为“体细胞联会”。在以后不断的复制中仍不分开，由此成千上万条核蛋白纤维丝合在一起，紧密盘绕，所以配对的染色体只呈现单倍数。黑腹果蝇的染色体数为2n＝2×4，其中第Ⅱ、第Ⅲ染色体为中部着丝粒染色体，第Ⅳ和第Ⅰ（X染色体）染色体为端着丝粒染色体（图10．1）。而唾腺染色体形成时，染色体着丝粒和近着丝粒的异染色质区聚在一起成一染色中心（chromocenter），所以在光学显微镜下可见从染色体中心处伸出6条配对的染色体臂，其中5条为长臂，1条为紧靠染色中心的很短的臂。

图10．1　果蝇唾腺染色体模式图

由于唾腺细胞在果蝇幼虫时期一直处于细胞分裂的间期状态，所以每条核蛋白纤维丝都处于伸展状态，因而不同于一般有丝分裂中期高度螺旋化的染色体。唾腺染色体经染色后，呈现深浅不同、疏密各异的横纹（band）。这些横纹的数目、位置、宽窄及排列顺序都具有种的特异性。不同染色体的横纹数量、形状和排列顺序是恒定的。利用这些特征不仅可以鉴定不同的染色体，还可以结合遗传实验结果进行基因定位。此外，体细胞同源染色体的配对有利于对染色体缺失、重复、倒位和易位等形态变异进行细胞学观察和研究。

三、实验材料

果蝇三龄幼虫。

四、实验用具和试剂

1．仪器用具

显微镜，双目解剖镜，培养瓶，载玻片，盖玻片，镊子，解剖针，吸水纸，乙醇灯，火柴等。

2．药品试剂

无水乙醇，冰醋酸，1％醋酸洋红，改良品红，生理盐水（0．7％NaCl），1M盐酸，蒸馏水。

3．培养基

玉米琼脂培养基。

五、实验步骤

1．幼虫培养

置于16℃～18℃下饲养，当幼虫爬上瓶壁准备化蛹前，即为三龄幼虫（图10．2），此时虫体肥大，便于解剖，是制备唾腺染色体的最理想时期。

图10．2　果蝇三龄幼虫

2．腺体剖取

检查幼虫培养瓶，取一只肥大的三龄幼虫，置于载玻片上，先在盛有水的培养皿中清洗身上的污物，然后把幼虫放在干净的载玻片上，并滴1滴0．7％的生理盐水，在解剖镜下辨认头部和尾部（图10．3）。首先熟悉幼虫结构，头部稍尖，并且有一黑点即口器不时地摆动。双手各持一个解剖针，在解剖镜下进行操作。果蝇的唾腺位于幼虫体前1／3～1／4处，用一解剖针压住头部，压点尽可能靠头部口器处即黑点的地方。因为幼虫会蠕动，这一步需先练习几遍。幼虫头部固定之后，再用另一解剖针压住虫体后端1／3的部位，固定幼虫（或用尖头镊子夹住）（图10．4），平稳快速一拉，使口器部分断开，体内各器官也从切口挤出，一对唾腺随之而出。唾腺是一对透明而微白的长形小囊，呈香蕉状，仔细观察可发现由一个个较大的唾腺细胞组成。唾腺的侧面常常有一些沫状的脂肪体（不透明）附着，可用解剖针把唾腺周围的白色脂肪体剥离干净。如果唾腺被拉断或未被拉出，可用解剖针在头部或身体处把其挤压出来。

图10．3　果蝇幼虫解剖图（仿Demerec和Kaufman）

图10．4　果蝇唾腺解剖部位（引王金法等，2008）

3．解离

染色前先将头部、身体等部位其他杂质清理干净，用吸水纸小心吸去生理盐水（注意吸水纸应离唾腺远些，以免吸附唾腺（图10．5）），向唾腺上加1滴1 M HCl，浸2～3min，使组织疏松，以便压片时细胞分散，染色体散开。

图10．5　果蝇的唾腺

4．染色

用吸水纸吸去盐酸，加1滴蒸馏水轻轻冲洗后吸干，加2滴醋酸洋红或改良品红染液，染色5～20min（此过程应保持腺体一直处于染液的浸泡中，如染液干了，要及时补充）。

5．压片

换上新鲜染液或45％醋酸，盖上盖玻片，将载玻片放在较平的桌面上，然后用吸水纸包被玻片，吸干多余染色液，并用手指轻压盖玻片，再用铅笔的橡皮头或解剖针柄垂直轻敲，或进一步用拇指在盖玻片上适当用力压玻片（注意：不能让盖片滑动），唾腺染色体即被压展开来。

6．观察

压好的玻片标本置显微镜低倍镜下找到分散好的标本，移至视野中心，然后转到高倍镜下观察。可以看到4对染色体，第一对染色体（XX或XY）组成一个长条，第二和第三对各自组成了具有左、右两臂的染色体对，它们都以中部的着丝区聚集，而第四对染色体很小，分布在着丝区呈点状或盘状。这样，从压好的较为模式的片子中便可看到5条弯曲展开的染色体臂（X、ⅡL、ⅡR、ⅢL、ⅢR）和一个点状的第四对染色体，它们在着丝区构成染色中心并向四周伸开。

对染色体分散、个体性清楚的片子，应仔细观察染色体的横纹数量、形状和排列顺序，以便对照模式照片辨认出不同的染色体臂（图10．6）。

图10．6　果蝇唾腺染色体

7．永久片的制作

（1）使盖玻片向下放入盛有45％醋酸＋95％乙醇（1∶1）的培养皿中。一端垫上一玻棒，使玻片稍为倾斜，过5～10min，可见盖玻片与载玻片分离。用镊子轻轻取出盖玻片于吸水纸上。

（2）有材料的一面向上，放入盛有95％乙醇＋叔丁醇（1∶1）的培养皿中3 min。

（3）换入纯叔丁醇中3min。

（4）用中性树胶封片。

六、作业及思考题

（1）绘制显微镜下所看到的果蝇唾腺巨染色体图，标明实际标本在观察中所能分辨的典型部位。

（2）每人制备1张染色体分散、横纹清晰的临时片。

（3）什么是染色中心（chromocenter）？

（4）根据所学的知识，说明联会（synapsis）应出现在什么类型的细胞中。

（5）利用巨大染色体可以进行哪些遗传学研究？