粗糙链孢霉的分离和交换

实验十一　着丝粒作图：粗糙链孢霉的分离和交换

一、实验目的

（1）学习粗糙链孢霉的培养方法和杂交技术。

（2）了解粗糙链孢霉的生活史。

（3）通过对链孢霉杂交产生的子囊孢子的统计分析，了解顺序四分体的遗传学分析方法，验证遗传学的基本规律，掌握有关基因的着丝粒距离的计算和作图。

二、实验原理

粗糙链孢霉（Neurospore crassa）属于真菌类，无性世代：通过菌丝有丝分裂发育成菌丝体，或由分生孢子发芽形成新菌丝体；有性世代：由两种生理类型（接合型）菌丝融合，或异型核结合形成二倍体合子。合子形成后立即进行减数分裂产生4个单倍体的核，称为四分孢子，然后四分孢子再经一次有丝分裂形成8个子囊孢子，并以4对“双生”，成线性排列在子囊中（图11．1）。

图11．1　散开的子囊孢子

三、实验材料

粗糙链孢霉的野生型菌株（Lys^＋）和赖氨酸缺陷型菌株（Lys^-）。

四、实验用具和试剂

1．仪器用具

培养箱，显微镜，镊子，解剖针，接种针，载玻片，试管，三角瓶，乙醇灯，滤纸，白布（10cm×10cm），灭菌锅。

2．培养基和药品

基本培养基（又称土豆培养基，供接种野生型菌株），补充培养基（供接种赖氨酸缺陷型菌株），玉米琼脂培养基（供杂交实验用），5％次氯酸钠等。

五、实验方法与步骤

1．菌种活化

为使菌种生活得更好，先要进行菌种的活化。从冰箱中取出保存的野生型和赖氨酸缺陷型的原种，把野生型接种在完全培养基，赖氨酸缺陷型接种在赖氨酸缺陷型培养基试管的斜面上，把接种好的试管放在28℃温箱培养5～6d，直至在试管中长成许多菌丝，并且在菌丝上部有许多分生孢子时（表明菌种活化成功）。

2．杂交

取野生型和Lys缺陷型的少许菌丝接种到同一试管的玉米琼脂培养基上，具体操作可采用下述两种方法。

（1）先接缺陷型，后接野生型，一次在杂交培养基上同时接种两亲本菌株的分生孢子或菌丝。然后在培养基上放入一灭菌的折叠滤纸，贴上标签，注明亲本及杂交日期。放入25℃温箱进行混合培养。5～7d就能看到许多棕色原子囊果出现，随后逐渐发育成熟，变大变黑，14d左右，就可在显微镜下观察。

（2）在杂交培养基上接种一个亲本菌株，25℃培养5～7d即有原子囊果出现。同时准备好另一亲本菌株的分生孢子，用无菌水中配成近于白色的悬浊液，将此悬浊液加到形成子囊果的培养表面，使表面基本湿润即可（每支试管约加0．5mL），继续在25℃下培养。原子囊果在加进分生孢子1d后即可开始增大变黑成子囊果，7d后即可成熟。

3．观察

（1）在长有子囊果的试管中加少量无菌水，摇动片刻，把水倒在空三角瓶中，加热煮沸，以防止分生孢子飞扬。

（2）用接种针挑出子囊果放在白布上，用解剖针轻压子囊果，若有坚实感则说明此子囊果发育正常。用解剖针在白布上来回拨动子囊果以去掉子囊果上的菌丝或培养基。然后取一载玻片，滴1～2滴生理盐水，将干净的子囊果置于载玻片上，用另一载玻片盖上，用手指压片，将子囊果压破，置显微镜下（10×15倍）检查，即可见30～40个子囊果。观察子囊中子囊孢子的排列情况。用载玻片盖上压片而不用盖玻片，是因为子囊果很硬，若用盖玻片压，盖玻片就会破碎。如发现30～40个子囊果像一串香蕉一样，可加1滴水，用解剖针把子囊拨开。压片时最好一次一个子囊果，多了压不好。片子压好后，置于10倍物镜下观察，观察时要顺时针方向进行，自中心向外确定子囊类型，计数并作好记录。此过程无须无菌操作，但要注意不能使分生孢子散出。观察过的载玻片、用过的镊子和解剖针等物都需放入5％次氯酸钠中浸泡后取出洗净，以防止污染实验室。

六、实验结果及说明

赖氨酸缺陷型的子囊孢子成熟较迟，当野生型的子囊孢子已成熟变黑时，缺陷型的子囊孢子还呈灰色，因而我们能在显微镜下直接观察不同的子囊类型。如果观察时间选择不当就不能观察到好的结果。过早都未成熟，全为灰色；过迟都成熟了，全为黑色，都不能分清子囊类型。所以，最好在子囊果发育至成熟大小，子囊壳开始变黑时，每日取几个子囊果压片观察，到合适时间置于4℃～5℃冰箱，在3～4周内观察都行。

七、思考及作业

（1）绘出显微镜下观察到的完整子囊图。

（2）根据实验统计结果，计算粗糙链孢霉Lys基因与着丝粒的距离。（要求写出公式计算及计算过程）

（3）在计算着丝粒距离的公式中，1／2的含义是什么？

（4）用图表示“＋＋----＋＋”这种子囊类型的形成。

八、参考图

（1）、（2）为非交换型子囊；（3）、（4）、（5）、（6）为交换型子囊；（7）、（8）、（9）、（10）是由转换造成的异常子囊

图11．2　粗糙链孢霉子囊类型