牡蛎染色体带型分析

实验十三　牡蛎染色体带型分析

一、实验目的

（1）掌握贝类染色体带型制备的方法。

（2）了解海产生物染色体带型分析的过程。

二、实验原理

带型、核型以及染色体形态特征都代表种的特征，即在一般情况下，在一个种群的所有个体或在同一个体的所有体细胞中，它们基本上是一致而稳定的。这就为动物种群的分类研究和确定在进化过程中所处的位置提供了重要的标准。

生物细胞中的染色体是遗传物质（基因）的载体。各种生物都具有特定而稳定的染色体组型或核型（包括染色体数目、形状和大小等特征）。据不完全统计，迄今共有31种牡蛎的染色体数目有报道，其中知道核型的20种有核型记录（表13．1）。从表13．1中可清晰地看出牡蛎科种类其染色体大多数为20条，特别是巨蛎属（Crassostrea）种类染色体均为20条，其中又以中部着丝粒或亚中部着丝粒（m／sm）染色体居多，NF＝40，未发现有异型和具随体的染色体。

表13．1　已知的牡蛎科的种类染色体数目与核型

（续表）

（续表）

仅从染色体外部形态和内部结构很难将其区分开，因此，高分辨显带技术的应用就显得尤为重要。同时，带型分析对染色体鉴别、基因定位以及杂交育种、多倍体育种的可能性研究等方面都能提供重要的理论依据。带型研究又称高分辨显带技术，能显示染色体内部结构，提供更多的具鉴定性特征的信息。但是，高分辨显带技术在瓣鳃纲的应用，与鱼类、哺乳类相比，差距甚大。有关采用显带技术分析牡蛎科种类也并不多。G带型分析在美国牡蛎（Rodriguez-Romero et al，1979；Leit2o et al，1999a）；太平洋牡蛎（郑小东等，1999；Leit2o et al，1999a）（图13），C．angulata，C．sikamea，C．ariakensis，C．gasar和S．commercialis（Leit2o et al，1999a，b）报道过；C带型分析在密鳞牡蛎（Insua　＆Thiriot-Quievreux，1991）和O．angasi（Li和Havenhand，1997）研究过；Ag-Nor带在太平洋牡蛎（郑小东等，1999；Leit2o et al，1999b）（图13），C．angu-lata，C．sikamea，C．ariakensis，C．gasar和S．commercialis（Leit2o et al，1999b），密鳞牡蛎（Insua　＆Thiriot-Quievreux，1991）报道过。

G带、C带和Ag～NOR带能够用来鉴定牡蛎的染色体，在核型基础上提供更为丰富的染色体的标记信息和形态特征，为深入理解牡蛎的进化关系、物种差异、种群分类等给予了有益的帮助和指导。当然，带型技术在牡蛎染色体研究中还存在不尽如人意的地方，有些物种间差异不显著，主要有以下几方面的原因：①采用成体组织细胞制备染色体，染色体易发生高度收缩而不能产生高分辨的带型；②带型技术本身重复性低，稳定性较差，引起这种情况可能与对环境的高感度有关；③细胞同步性过低大大影响了制备良好染色体分裂相的几率，进而为显带操作带来困难。虽然细胞培养能获得发育同步的细胞系，可以得到较多具一致分裂期的分裂相，但在牡蛎中应用甚少。

三、实验材料

成熟的2龄太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）。

四、实验用具和试剂

1．仪器用具

显微镜，离心管（或培养皿），解剖刀，剪子，镊子，载玻片，盖玻片，吸管，烧杯，加热器，500目筛绢，300目筛绢，温度计，恒温水浴锅，染色缸等．

2．药品试剂

秋水仙素，甲醇，冰醋酸，吉姆萨（Giemsa）染液，磷酸缓冲液（pH值为6．8～7），氯化钾，胰酶，硝酸银，明胶等。

五、实验方法和步骤

1．染色体制备

（1）取卵：先把成熟的牡蛎外壳洗刷干净，活体解剖后，选择成熟的种贝，用滴管刺破性腺获取精、卵，先用300目筛绢过滤一次，再用500目筛绢洗去组织液，卵子最好需海水浸泡30min。

（2）授精：把获得的好精、卵进行人工授精，在水温22℃～25℃条件下进行发育。

（3）秋水仙素处理：当胚胎发育至4～8细胞期时，立即用500目筛绢网浓缩出胚胎，放入用50％海水配制的0．05％的秋水仙素的离心管中处理30～40 min。

（4）低渗：移入25％海水中（或0．075M的KCl液）低渗30～45min。

（5）固定：低渗结束后移入盛有卡诺氏固定液（甲醇∶冰醋酸＝3∶1）内固定，固定液需要更换3～4次，每次时间15min。

（6）空气干燥法制片。

（7）镜检：光学显微镜下选择具有分散好、形态完整的中期染色体的片子，用于带型分析。

2．染色体显带

（1）G带：胰酶法（余先觉，1989）。

程序如下：选择优良的染色体制片，片龄3～5天，将片子放入浓度为0．025％的胰酶溶液中处理1～2min，立即甩掉片上的胰酶溶液，并用37℃的PBS（磷酸缓冲液，pH＝6．98）冲洗，晾干，然后用5％的Giemsa染色10～20 min，无离子水冲洗1～2min，晾干后镜检。

（2）银染法：参照Howell和Black的快速银染法（余先觉，1989）。

程序如下：将50％硝酸银溶液（事先过滤）与2％明胶溶液2∶1混合后，立即滴加到染色体制片上并覆以盖玻片，在65℃的温箱内处理10～20min，待玻片呈棕黄色时取出，流水冲洗，晾干后镜检。若染色体着色不够，可用2％Gi-emsa复染1～2min即可。

3．带型分析

选择10个分裂中期的细胞，其染色体分散良好、带型清楚，进行显微摄影，放大，洗印成相片。结合形态，根据带型分清每一对同源染色体。使之配对并按长度、着丝点位置等指标排列起来，选择一张清晰而标准的相片，作成G带、Ag-Nor带型核型图（图13．1右）。同时，根据相片分析和显微镜观察确定染色体带的数量、相对位置、颜色深浅宽窄等特征（表13．2和13．3），测绘出它们的模式图（图13．1左）。

表13．2　太平洋牡蛎各染色体G带分布

表13．2　太平洋牡蛎胚胎细胞染色体的Ag-NORs数量

六、作业

（1）制备染色体带型片子各2～3张。

（2）染色体带型结果分析——数据统计、核型图以及核型模式图。

（3）实验过程的体会。

七、参考图谱

图13．1　太平洋牡蛎G带（左）模式图和Ag-Nor带（右）的细胞分裂相