一、实验目的
（1）掌握水产动物同工酶实验技术。
（2）了解水生生物同工酶分析在遗传育种学研究的意义。
（3）掌握电泳分析和染色方法。
二、实验原理
同工酶（isoenzyme）是指催化的化学反应相同，酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。这类酶存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织，甚至同一组织或细胞中。现已发现有数种同工酶。如6-磷酸葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶、酸性和碱性磷酸酶、肌酸磷酸激酶、核糖核酸酶、过氧化酶等，其中乳酸脱氢酶最为大家所熟悉。
同工酶技术是近年来发展起来的一项新技术。利用同工酶所带电荷的不同和分子大小形状的不同，在电场和凝胶中出现各同工酶组分的迁移率不同，通过电泳和组织化学方法进行特异性染色而把酶蛋白分子分离，并将其位置和活性直接在染色区带标记出来。酶蛋白所显示的图像称为酶谱。根据谱带位置、数目及吸收强度等进行比较分析，判定生物的遗传特性。（图15．1）
电泳的种类，因支持物的不同而异，用纸作支持物的称为纸电泳，用凝胶作支持物的称为凝胶电泳。纸电泳只能根据组分自由泳动率的不同将它们分开，当组分的自由泳动率相差很小时，就得不到满意的分离效果。凝胶电泳不仅可以把自由泳动率差别很大的组分分开，而且可以借助分子筛的作用把自由泳动率差别小的组分分开。纸只能作单纯的支持物，它本身不参与分离过程。凝胶不仅作为支持物，由于有较高的黏度，在电泳时产生一定的摩擦力，还有一定大小的孔洞，电泳时能和移动的颗粒相互作用，主动参与分离过程。假如凝胶的孔洞与所分离的蛋白质分子的平均大小接近，那么蛋白质分子通过凝胶孔洞的难易程度就不同，这与蛋白质分子的大小、形状有关，这样就为分离自由泳动率接近的大分子提供了一种简单有效的方法。因此，目前分离同工酶的技术主要是用凝胶电泳。常用的凝胶有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维薄膜和聚丙烯酰胺凝胶等。
图15．1 同工酶电泳原理
三、实验材料
新鲜的贝类、鱼类组织或-80℃冻存的样品。
四、实验用具和试剂
1．仪器用具
微量匀浆机，高速冷冻离心机，多用电泳仪，抽气机，电炉或微波炉，多层滤纸，pH仪，制胶模具，研钵、染色盒，冰箱，恒温培养箱，分析天平，电子天平，数码相机等。
2．药品试剂
水解马铃薯淀粉（Starch），三羟甲基氨基甲烷（Tris），柠檬酸，乳酸，乙二胺四乙酸（EDTA），乙二胺四乙酸二钠盐，苹果酸，乳酸，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，辅酶Ⅰ（NAD），辅酶Ⅱ（NADP），吩嗪甲酯硫酸盐（PMS），氯化硝基四氮唑兰（NBT），异柠檬酸三钠，6-磷酸葡萄糖酸钠，乙醇，丙酮，α-萘乙酸，a-Glycerol phosphate，Glucose-6-phosphate，溴酚蓝，快蓝RR盐，冰醋酸，盐酸，氢氧化钠，氯化镁。
3．缓冲液（配制方法见附录）
CT-7．0制胶缓冲液；CT-8．0制胶缓冲液；CAPM-7．0制胶缓冲液。
五、实验步骤和流程（图15．2）
（1）样本活体解剖，将各组织（如肝脏、外套肌、眼等）置于1．5mL离心管中，编号放入-80℃冰箱中保存备用；血液需要加肝素抗凝，于4℃冰箱中保存，备用。
（2）电泳前取0．3g左右样品放入1．5mL离心管，加入等体积的蒸馏水中后置于冰浴中研磨，研磨混合液置于冷冻离心机中，在4℃、12 000r·min-1的条件下离心直至上清液澄清，取上清液冷冻保存备电泳用。对于血液试样，待分离出血清后上样。
（3）加淀粉30g和制胶缓冲液254mL，在三角烧瓶内混匀，加热至沸腾，抽气，然后注入制胶模具中，冷却后，保鲜膜密封保存备用。
（4）用手术刀在凝胶距离边1／3（约2．5cm）处切开，用适当大小的滤纸片蘸取样品提取液放入切口中。上样完毕后，用滤纸搭盐桥。在4℃条件下稳流（18mA）电泳5h。电泳后将凝胶割成1～1．5mm厚的胶片，置于染色盒中，将配制好的染色液倒入染色盒后置于37℃的恒温箱中进行染色。各种酶的染色液见附录5。待酶显示足够的活性后，用7％的冰醋酸溶液终止反应。
取凝胶放于大小合适的玻璃纸上，压制封膜，晾干，编号保存。
（5）对凝胶及其谱带拍照，或用激光扫描仪对干胶片电泳谱带进行扫描。
（6）结果分析：根据酶的结构组成和同工酶的在组织中所表现的酶谱特征，确定每种同工酶的编码基因位点、多态位点的等位基因频率。
图15．2 同工酶电泳实验流程
六、实验作业
（1）提交清晰的同工酶酶谱图1～2张。
（2）同工酶技术的特点是什么？
（3）同工酶技术在水产遗传育种中如何应用？
七、参考图谱
图15．3 日本无针乌贼同工酶图谱
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