水产动物细胞相对含量测定

实验十六　水产动物细胞DNA相对含量测定

一、实验目的

（1）了解细胞DNA相对含量测定和染色体倍性检测的方法。

（2）学习流式细胞仪的使用方法。

二、实验原理

流式细胞术（Flow Cytometer，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行DNA／RNA定量分析和分选的检测手段。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，是当代最先进的细胞定量分析技术。

用DNA-RNA特异性荧光染色（如4，6-diamidino-2-phenylindole，即DA-PI）对细胞进行染色，在流式细胞仪（图16．1）上用激光或紫外光激发结合在DNA上的荧光染料，依次检测每个细胞的荧光强度，因DNA含量的不同得到荧光强度的不同分布峰值，与已知二倍体细胞或单倍体细胞（如同种精子）的荧光强度对比，或与已知DNA含量的细胞（如鸡血细胞）进行比较，判断被检测细胞群的倍性组成（图16．2）。采用流式细胞仪测量细胞核的DNA含量来检测倍性的方法已广泛应用于贝类、鱼类和甲壳类。

图16．1　流式细胞仪

对成体贝类来说，取样自鳃组织、血淋巴、外套膜组织、出水管以及足部组织的活组织样品均可用于流式细胞术分析。除了用上述成体的组织外，直线铰合幼虫、眼点幼虫均成功地应用该方法进行倍性鉴定。

三、实验材料

贝类、鱼类的新鲜组织（鳃、肾脏等）以及血细胞。

四、实验用具和试剂

1．仪器用具

流式细胞仪，过滤器，离心管（或培养皿），解剖刀，剪子，镊子，滤网等。

2．药品试剂

PBS缓冲液（140mmol·mL^-1NaCl，2．6mmol·mL^-1KCl，4mmol·mL^-1KH₂PO_4，8mmol·mL^-1Na₂HPO₄），RNA酶，碘化乙锭。

五、实验步骤

1．单细胞悬液的制备

分别取0．5～1g新鲜组织（鳃、闭壳肌或者性腺），经PBS缓冲液冲洗后置于重叠的100目铜网和260目尼龙网上轻搓，磨取并过滤分散的细胞，用缓冲液不断冲洗，直至组织搓完。将组织溶液移至离心管中，离心漂洗3次，离心速率为800～1000r·min^-1，每次5min。除去上清液，收集沉积细胞，以备染色。

2．细胞核DNA荧光素定量染色

在盛有分散细胞的试管内加入染色缓冲液，常温下暗处染色30min左右，然后用500目尼龙网过滤，滤液用机用标准试管收集。用PBS缓冲液调整细胞浓度，保持细胞浓度为10⁶mL^-1。染色缓冲液成分为：PBS缓冲液内加入3　000URNA酶和10μmol·mL^-1碘化乙锭（PI）。

3．DNA含量测定

采用流式细胞仪分别测试每份样品的DNA含量。流式细胞仪的激光照射经PI染色的细胞即促发荧光，测定所发荧光的强度。与测定装置相连的自动分析装置可对测定结果进行初步的分析。选取重复间变异率小于5％的数据平均值作为测定结果。每份样品测5×10³个细胞，重复3次。

解冻的样品要经涡旋振荡器振荡、注射器反复抽吸、筛网过滤，制成细胞悬液，方可上机分析。

六、作业

（1）流式细胞仪的使用方法。

（2）DNA相对含量的比较和倍性检测分析。

七、参考图谱

A二倍体，B三倍体

图16．2　流式细胞仪检测太平洋牡蛎倍性图