水产动物基因组总的提取

实验十七　水产动物基因组总DNA的提取

一、实验目的

（1）了解水生生物基因组DNA分离的原理和方法。

（2）掌握大量提取水生动物基因组DNA的方法与技术。

二、实验原理

DNA提取是指通过物理和化学方法使DNA从样品的组分中分离出来。提取DNA是分子生物学研究工作的第一步，DNA质量的好坏关系到后续工作的成功与否。好的DNA提取方法应该是提取的DNA分子较完整，降解较少，蛋白质、多糖、多酚等杂质去除较彻底，同时具有较高得率。DNA提取方法繁多，CTAB法是水生生物DNA提取较为常用的方法。溴代十六烷基三甲胺（CTAB，cetyltrimethylammonium bromide）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与DNA形成复合物，溶解于高盐溶液中（0．7mol·L^-1NaCl），当降低溶液盐浓度到一定程度（0．3mol·L^-1NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白、多糖类物质分开。最后，通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。

三、实验材料

新鲜的贝类、鱼类肌肉组织或-80℃冻存的样品。

四、实验用具和试剂

1．仪器用具

水浴锅，冷冻离心机，移液枪，高压灭菌锅，-80℃冰箱，4℃冰箱，pH计，磁力搅拌器，分析天平，1．5mL离心管，离心管盒，枪头盒及Tip头（白0．1～10μL，黄10～20μL，蓝10～1000μL），解剖刀剪，镊子，记号笔，乳胶手套，广口瓶和吸水纸。

2．药品试剂

三羟甲基氨基甲烷（Tris），HCl，乙二胺四乙酸二钠（Na₂EDTA·2H₂O），SDS，蛋白酶K（PK），Tris-饱和酚，酚∶氯仿∶异戊醇，NaCl，无水乙醇，双蒸水，β-巯基乙醇（2-ME），CTAB。

3．试剂制备

（1）CTAB缓冲液配方：0．2％（V／V）2-ME（β-巯基乙醇，Sigma，M-3148）；2％（W／V）CTAB（十六烷基三乙基溴化胺，Sigma，H-6269）；100mM Tris-HCl，pH8．0；20mM EDTA．Na₂，pH8．0；1．4MNaCl。

＊灭菌后室温避光保存，几年内可以保持稳定。

（2）PK：蛋白酶K（20mg·mL^-1，蒸馏水溶解），-20℃。

（3）PCI（酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1），4℃。

（4）LiCl：饱和水溶液，4℃保存，或者NaCl饱和水溶液。

（5）无水冰乙醇：预冷，-20℃保存，或者用等体积异丙醇，预冷，-20℃保存。

（6）70％乙醇：配制好后，4℃保存。

（7）TE（裂解缓冲及DNA保存液）：10mM Tris-HCL，pH8．0～100mM EDTA，pH8．0，RT。

五、实验步骤（图17．1）

（1）取贝或鱼的肌肉组织100mg，尽量切碎（图17．1a），放入灭菌1．5mL离心管中。

（2）每管加入预热的CTAB缓冲液（60℃）500μL，蛋白酶K（PK）（20mg·mL^-1）15μL，60℃温浴过夜。

（3）加入等量500μL CIA（氯仿∶异戊醇＝24∶1），旋转搅拌20min（图17．1b），然后在10　000r·min^-1下，室温离心5min。

（4）吸取上清液（图17．1c），加入等量PCI，室温混合20min，10　000r·min^-1下室温离心5min。

（5）加等量CIA，旋转搅拌20min；10　000r·min^-1下室温离心5min，重复1次。

（6）加入0．6倍体积的异丙醇，缓慢颠倒混合至DNA出现（图17．1d）；12　000r·min^-1下室温离心15min。

（7）倒掉上清液，加入1mL预冷无水乙醇清洗，10　000r·min^-1，室温离心1min；重复1次。

（8）倒掉上清液，离心管倒放自然晾干30min（图17．1e）。

（9）待DNA完全干燥后，溶于50μL　1×TE（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8．0）中，4℃溶解过夜。

（10）用紫外分光光度计将DNA浓度调整为100ng·μL^-1，置于4℃备用。

图17．1　DNA提取

a切取组织；b搅拌；c取上清液；d DNA获取；e干燥

六、实验注意事项

（1）组织未完全消化至澄清可补充适量PK。

（2）取上清液时不能触及下面液相。

（3）高温与剧烈震动损伤DNA。

（4）各器皿及配液均需高灭菌（Tip头，离心管，玻璃瓶，配液）。

（5）移上清液时，用黄色大口Tip头（剪口后经乙醇灯烧烤）。

（6）酒精固定的样品，首先经蒸馏水37℃温浴（2～3次），洗脱酒精。

七、实验作业

（1）CTAB提取缓冲液中各种成分的作用是什么？

（2）无水乙醇和异丙醇沉淀DNA各有什么优点？

八、参考图谱

图17．2　DNA模板电泳图谱