茶树组织培养技术

实验实训二　茶树组织培养技术

一、实训目的

通过学习茶树种子子叶的培养，初步了解组织培养的原理及基本技术，并掌握适宜培养基的选用、配制技术。

二、实训内容

组织培养，即利用植物种子或其他器官的某一部分，在特制的培养基上，经过一定时期的培养，使之形成新的植株。这对某些繁殖系数小、种子少或不结籽的珍贵植物资源来说尤为重要。

茶树结实率低，且有一些品种不结实，无性繁殖系数又小，必须采用组织培养来扩大繁殖系数。此外，组织培养在DNA的导入、体细胞杂交等方面都得到广泛应用。

茶籽子叶培养大致分四个步骤：材料处理、培养小苗、根的诱导培养、移栽。

三、材料与实训用品

（一）材料

①待培养的茶树种子若干粒。

②药品：

MgSO₄・7H₂O，CaCl₂・2H₂O，KNO₃，NH₄NO₃，KH₂PO₄，FeSO₄・7H₂O，Na₂-EDTA，KI，CoCl・6H₂O，ZnSO₄・7H₂O，CuSO₄・5H₂O，H₃BO₃，Na₂MnO₄・2H₂O，甘氨酸，6-BA，IBA，V_B1，V_B6，烟酸，琼脂，KOH，HCl，次氯酸钠溶液，95%乙醇，精密试纸等。

（二）实训用品

超净工作台，培养箱（或培养室）一个，高压灭菌锅一个，电炉，玻璃器皿，弯头镊子，尖头镊子，手术刀，酒精灯，滤纸，防潮纸，橡皮圈等。

四、步骤及方法

（一）培养基母液配制

母液Ⅰ（实训表2.3）：

实训表2.3　母液Ⅰ的使用药品量

将实训表2.3的药品称取后溶于800mL无离子水中，另称取4.400g的CaCl₂・2H₂O溶于100mL无离子水中，二者混合、定容至1000mL，混匀置于棕色试剂瓶冷藏保存。

母液Ⅱ（实训表2.4）：

实训表2.4　母液Ⅱ的使用药品量

将实训表2.4的药品称取后，溶于无离子水中，定容至1000mL，混匀，置棕色试剂瓶冷藏保存。

母液Ⅲ：称取3.730g的Na₂—EDTA溶于150mL热无离子水中，再将27.800g的FeSO₄・7H₂O溶于100mL无离子水中，混匀，定容至1000mL，置棕色试剂瓶冷藏保存。

母液Ⅳ（实训表2.5）：

实训表2.5　母液Ⅲ的使用药品量

称取实训表2.5中的药品量，将其溶于无离子水中，定容至100mL，混匀，置100mL棕色试剂瓶冷藏保存。

母液Ⅴ：称取20mg的6-BA，并加入少量0.1N的HCl溶解后，加无离子水混匀，定容至100mL，混匀，置100mL棕色试剂瓶冷藏保存。

母液Ⅵ：称取20mg的IBA，加少量95%乙醇溶解，然后加无离子水混匀，定容至100mL混匀，置棕色试剂瓶冷藏保存。

（二）培养基配制

①称取蔗糖30g，置1000mL烧杯中，加入母液Ⅰ100mL。母液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ各10mL，母液Ⅵ20mL，搅拌使蔗糖充分溶解。

②称取琼脂5g，置500mL三角瓶，加无离子水300mL左右，加温至沸，文火使其完全溶解（切勿溢出）。

③将制剂2倒入制剂1内充分搅拌，加无离子水定容至1000mL，倒入烧杯内，用0.1NHCl或0.1NKOH调至pH5.7左右。

④将步骤③配制的溶液趁热用分注器，注入500mL三角瓶内，每瓶20mL。

⑤用棉花塞将瓶口塞紧，用防潮纸包住棉花塞及瓶颈，然后用橡皮筋捆紧。

⑥将上述做好的培养基置高压蒸汽灭菌器内，110～113℃下保温15min。

⑦将压力表降至零时，将培养瓶取出，平置阴凉、干净处。

（三）其他化学试剂配制

①0.1NHCl100mL；

②0.1NKOH100mL；

③饱和次氯酸钙溶液（加入少许肥皂水）。

（四）消毒及接种

1.容器消毒

φ10cm的培养皿10个（内置滤纸一张），100mL烧杯3个，分别装入牛皮纸袋内，铁夹子封口，置烘箱内120℃保温1h，然后移入接种箱中。

2.材料消毒及接种

①将4℃下贮存一周以上的新鲜茶果去除果壳，置放有70%乙醇的烧杯中，浸泡3min转入有饱和次氯酸钙溶液中，烧杯外部和内部与次氯酸钙不接触处用浸有乙醇的脱脂棉擦洗后，放入已经消毒过的接种箱（或超净工作台）内。15min后，用无离子水在无菌烧杯内充分洗净，置无菌培养皿内备用。

②用肥皂将手洗净，用浸有70%乙醇的脱脂棉将手擦洗一遍，将手伸入培养箱操作。

③左手捏住茶籽，右手持无菌尖头镊子，从种脐处挑开茶籽种壳，将胚置于无菌培养皿内，从子叶柄处切除胚轴，将每片子叶切成4块，接种在培养基上，封好瓶口。

④置22～30℃，光强1500lx，光照12h培养箱或培养室培养。

（五）注意事项

①接种箱周围环境必须洁净，最好每次使用前用灭菌剂消毒。

②防止人身带入杂菌。

③镊子、手术刀最好每操作一次就在70%乙醇溶液中浸泡好，在酒精灯上烤干。

五、作业

1.填写实训报告。

2.简述茶籽子叶组织培养的步骤及技术要点。