苗种繁育岗位年度工作综述

2　苗种繁育岗位年度工作综述

2．1　牙鲆与夏鲆杂交组合及子代生长测定和评价

采用5×8因子设计法，5条雌鱼的卵分别与8条雄鱼的精子进行人工授精。雄鱼精液在实验前首先通过超低温冷冻保存技术贮存。将每个家系约3万尾初孵仔鱼放入30m³水体混合培育，共建立了40个全同胞家系。仔鱼从第40天开始进行生长数量性状包括体长、体高、全长、体重等测量，之后每半个月对仔鱼进行生长数量性状的测量。子代长至4个月后进行物理标记，剪取鳍务并采用微卫星座位对混合养殖群体进行了亲权关系的鉴定。180日龄之前杂交鲆体长和体重均未表现出杂种优势，杂种优势率值始终为负值，但是绝对值在逐渐减小。从196日龄之后杂交鲆杂种优势开始表现出来，并且在196日龄之后杂种优势率显著的增加。256日龄体长杂种优势率为14．29%，体重杂种优势率为59．78%，271日龄体长杂种优势率达到27．36%，体重杂种优势率为102．32%。最终从40个全同胞家系中初步筛选出5个交配组合。2011年在胶南水产育苗厂、威海市益恒水产有限责任公司育苗厂、

日照市海洋水产资源增殖站育苗场共培育夏鲆与牙鲆杂交苗种258万尾，杂交受精率80%

以上，孵化率85%以上，苗种培育成活率50%以上。

2．2　大菱鲆受精卵质量评价

对大菱鲆早期发育的研究发现，大菱鲆受精卵从形态上呈圆球形，无色透明，中央有油球1个，亦无色透明，卵径范围为0．91～1．20mm。HOWELL和SCOTT报道大菱鲆受精卵卵径范围是0．97～1．10mm，在每一繁殖季节期间卵径存在下降趋势。该研究结果显示大菱鲆受精卵卵径大小为1．00mm左右，其平均值为（1．053±0．020）mm，处于以往研究结果的上限，这与该研究所选择大菱鲆亲鱼的产卵周期有关。该研究所采用的大菱鲆亲鱼为苗种繁育后期的预备亲鱼，亲鱼处于产卵繁殖周期中期，营养积累比较充足，性腺发育成熟充分，因此卵径比较大。

该研究结果显示大菱鲆不同批次的受精卵卵径间未检测到显著的差异，双变量相关统计分析结果显示大菱鲆卵径与悬浮率、受精率和孵化率间皆未检测到显著的相关性。因此，以卵径作为卵质评价的形态学指标需要谨慎，为有效进行卵质评价，有必要筛选多组形态学参数如卵裂对称性进行综合形态学评价。研究中选择与蛋白质和糖等能量代谢相关的关键酶谷草转氨酶（AST）和丙酮酸激酶（PK）作为生理生化指标对大菱鲆卵质进行评价。统计结果显示大菱鲆受精卵孵化率与AST相对活力存在显著相关性，当AST相对活力大于（15．159±0．825）U／mg时，大菱鲆受精卵孵化率皆高于20%；悬浮率和受精率与AST相对活力间无显著相关性，受精率是衡量亲鱼繁殖特征和卵子质量的重要指标，本研究中所测定的受精率是以原肠期中期受精卵数占总卵数的百分比进行统计，这可能是造成本研究中大菱鲆受精率普遍较低，同时也是导致受精率与AST相对活力间无显著相关性的原因。综上所述，本研究结果表明AST相对活力可以作为用于评价大菱鲆卵质的生理生化参数，同时研究表明蛋白质在大菱鲆受精卵能量代谢过程中是一个重要的能量来源，对大菱鲆受精卵活力的维持起着重要的作用。在大菱鲆卵质检测中，其悬浮率、受精率和孵化率与PK间均无显著的相关性，研究结果表明，糖在大菱鲆受精卵能量代谢过程中可能不是主要的能量来源，在该研究中不适合作为大菱鲆卵质评价的指标。

2．3　鲆鲽类雌核发育诱导及培育

2．3．1　牙鲆雌核发育家系及群体的诱导、鉴定和培育

目前累计建立培育牙鲆异质雌核发育家系12个、群体4个，同质雌核发育牙鲆群体3个。2011年新建立和培育异质雌核发育家系2个。通过形态学观察鉴定UV照射精子DNA的灭活率为100%，经加倍获得了100%的雌核发育牙鲆。现尚有38～39日龄鱼苗约30　000尾，全长1～1．2cm。图1显示2011年诱导的2个异质雌核发育家系。

2010年诱导获得的异质雌核发育家系4个，继续进行常规培育，目前有1～1．5龄鱼730余尾，全长16．66～30．92cm，体重44．48～341．63g。2．3．2　牙鲆同质雌核发育群体的培育

2010年诱导获得的同质雌核发育群体2个，目前尚有1～1．5龄鱼35尾，全长16．23～32．17cm，体重46．94～441．71g。2008年诱导获得的同质雌核发育群体，目前尚有3龄鱼3尾，全长49．59～56．81cm，体重1195．38～1890．62g。图2显示培育的同质及异质雌核发育家系。

图1　2011年2个异质雌核发育家系

图2　雌核发育群体的培育

2．3．3　雌核发育伪雄鱼的诱导和培育

尚在培育的2龄雌核发育性反转假雄鱼50余尾，全长32．43～37．69cm，体重317．28～492．82g，其雄性化率为100%，参见图3。目前也正在准备进行2012年10月获得的雌核发育牙鲆的假雄鱼诱导。

图3　雌核发育伪雄鱼的诱导

2．3．4　牙鲆三倍体诱导和培育

2011年度筛选和优化了牙鲆三倍体的处理方法和条件，依此进行了多次规模化诱导。春季诱导的牙鲆三倍体40日龄鱼苗有3　000余尾，后又发生了秃尾病，故将实验鱼苗全部倒掉，未能继续培育。秋季又继续规模化诱导牙鲆三倍体6次，共获得诱导组初孵仔鱼约741　000尾。其相对受精率、孵化率分别为42．25%～84．34%、26．70%～97．55%，原肠胚期染色体计数检测其三倍体率为94%～95%，流式细胞仪检测其三倍体率为97．5%～100%。目前正在培育，并进行其和对照组生长发育对比观察。现尚有38～39日龄牙鲆三倍体诱导鱼苗70　000余尾，流式细胞仪检测变态期三倍体率为97．5%。22～23日龄牙鲆三倍体诱导鱼苗400　000余尾，17～18日龄牙鲆三倍体诱导鱼苗150　000余尾，流式细胞仪检测它们的三倍体率均为100%。图4，图5分别显示牙鲆三倍体培育及倍性鉴定。

图4　牙鲆三倍体诱导及培育

图5　牙鲆、大菱鲆三倍体的倍性鉴定

2．3．5　大菱鲆三倍体诱导和培育

2011年度筛选和优化了大菱鲆三倍体的处理方法和条件，依此进行了多次规模化诱导。春季诱导获得的鱼苗同样由于亲鱼产卵后期卵质下降及病害等问题，未能继续培育。秋季继续规模化大菱鲆三倍体诱导3次，获得诱导组初孵仔鱼约430　000尾，其相对受精率、孵化率分别为47．10%～97．86%、69．26%～79．50%，原肠胚期染色体计数检测其三倍体率为88%～92%，流式细胞仪检测其三倍体率为97%～100%。目前正在培育，并进行其和对照组生长发育对比观察。现尚有大菱鲆三倍体诱导鱼苗约110　000尾，全长2．5cm左右，流式细胞仪检测该期三倍体率为100%。图5、图6显示大菱鲆三倍体诱导倍性鉴定及培育。

图6　大菱鲆三倍体诱导及培育

2．3．6　牙鲆四倍体诱导和培育

通过筛选以及前期的工作基础，进一步对处理时刻、压力和时间等牙鲆四倍体诱导参数进行优化。观察计算了其受精率、孵化率，并结合其原肠胚期染色体计数和仔鱼期流式细胞仪等测定的诱导率进行综合评价，进一步优化了牙鲆四倍体诱导条件，其原肠胚期染色体计数检测四倍体诱导率均在10%～30%之间，仔鱼期流式细胞仪检测的四倍体率在40%～73%之间。

对2010年春、秋季获得的牙鲆四倍体诱导组鱼进行培育，现尚有1～1．5龄实验鱼163尾（全长为17．92～27．62cm，体重为60．68～304．54g）。下一步将利用流式细胞仪对培育苗种的四倍体比例进行检测。

2．3．7　大菱鲆四倍体诱导参数的优化和诱导培育

在2010年实验结果的基础上，进一步通过单因子和正交实验对处理时刻、压力和时间等诱导参数进行优化。观察计算了其受精率、孵化率，并结合其原肠胚期染色体计数和仔鱼期流式细胞仪等测定的诱导率进行综合评价，进一步优化了大菱鲆四倍体诱导条件，其原肠胚期染色体计数检测四倍体诱导率均在10%～20%之间，仔鱼期流式细胞仪检测的诱导率在25%～73%之间。

2011年6月诱导获得大菱鲆四倍体实验组初孵仔鱼144　000尾，其相对受精率、孵化率分别为62．37%、17．06%，原肠胚期染色体计数检测四倍体诱导率10%，流式细胞仪检测其5日龄鱼苗的四倍体率为13%。现尚有大菱鲆四倍体诱导组6月龄苗种2　500余尾（全长10．57～11．75cm，体重29．64～38．34g），将对其倍性进行检测。

2．4　牙鲆与夏鲆杂交及回交子代的胚胎与仔鱼发育及生物学特征

2．4．1　六组组合的受精率、孵化率及杂交适合度

六组组合的受精率、孵化率及杂交适合度见表1。牙鲆（94．7%）、夏鲆（85．4%）及正交鲆（97．7%）的受精率没有明显差别（P＞0．05），但反交鲆（41．7%）的受精率要显著低于亲本对照（P＜0．05）。反交鲆中大量胚胎在卵裂期出现畸形，只有约41．7%的胚胎可以通过原肠期。一旦胚胎发育通过了原肠期，一直到孵化前，胚胎发育都可以正常进行，没有明显的异常发育现象发生。回交牙鲆（93．2%）和回交夏鲆（94．2%）的受精率介于牙鲆与夏鲆之间，与亲本没有明显差别（P＞0．05）。

牙鲆（72．5%）与夏鲆（74．5%）的孵化率之间没有明显差别（P＞0．05），正交鲆（84．4%）显著高于亲本对照（P＜0．05），反交鲆孵化率（78．1%）与亲本没有明显差别（P＞0．05）；两组回交子代中，回交夏鲆（93．1%）的孵化率明显高于其余五组（P＜0．05），正交鲆及回交牙鲆（85．8%）的孵化率较回交夏鲆低，但仍明显高于牙鲆、夏鲆及反交鲆。

对六组的杂交适合度值（CFM）进行One way ANOVA分析发现，回交夏鲆的杂交适合度值显著高于其余五组（P＜0．05），牙鲆、正交鲆及回交牙鲆之间没有明显差别（P＞0．05），但要显著高于反交鲆（P＜0．05）。

表1　牙鲆、夏鲆、正反交及回交子代的受精率、孵化率和杂交适合度

表内数值为平均值±标准差，同一行内参数后字母不同表示经过SNK检测后差异不显著（P＞0．05）。

2．4．2　六组组合胚胎发育观察

牙鲆、夏鲆、正反交及两组回交的受精卵为端黄卵，浮性，圆球形，卵径0．89～1．02mm，卵黄均匀透明，油球1个，直径0．15～0．27mm。正交子代及两组回交子代的胚胎发育规律与双亲的发育规律基本一致。都经历了以下几个时期：

（1）卵裂前期：受精膜举起，卵周隙狭小，各组之间没有明显差别。原生质向动物极集中形成胚盘。

（2）卵裂期：胚盘中部出现凹陷，不久发生等分裂，细胞数目呈几何级数增长，经过2细胞、4细胞、8细胞……多细胞，胚胎细胞在动物极形成多层，发育成为桑葚胚。在卵裂期阶段，牙鲆及正反交鲆卵裂球的边缘较为平滑，而夏鲆及回交牙鲆、回交夏鲆的卵裂球外缘细胞分开，使卵裂球外缘呈波浪形。这种卵裂球形态的不同是与遗传有关还是胚胎发育环境的不同随机造成仍需进一步研究确认。反交鲆胚胎在该阶段出现大量异常胚胎，仅有40%～50%的卵子能通过原肠期继续发育，其余各组在卵裂期均可正常发育。

（3）囊胚期：桑葚胚期以后，随着细胞分裂的继续，细胞数目增加、体积变小，胚胎发育至囊胚期。囊胚初期细胞在动物极呈帽状（高囊胚），胚体围成一空腔即囊胚腔；囊胚细胞继续向植物极发育延伸，进入低囊胚。

（4）原肠期：胚胎细胞包围卵黄囊，形成胚环、胚盾，进入原肠早期；之后胚体收缩伸长，进入原肠中、晚期，同时形成胚孔。

（5）神经胚：胚孔封闭，胚体中央明显加厚，形成神经板，随后神经褶、神经管逐渐形成。

（6）器官发生期：胚体头部两侧向外隆起，眼泡形成，随后形成克氏泡；身体中部逐渐形成5～6对肌节；眼泡前部形成嗅板，色素细胞开始出现，在胚体上可见零星散布的黑点，晶体不明显，视泡已经变成视杯；随后晶体形成，和视杯一起构成眼睛；在眼泡后方可见一对泡状结构的听囊，胚体尾部开始扭转，胚体呈“V”形附于卵黄囊上。

（7）尾芽期：尾部出现尖端，胚胎发育至尾芽期，此时胚体为26～28对肌节。

（8）肌肉效应：胚体尾部开始出现肌肉效应，出现间断性收缩；不久心跳出现。

（9）脱膜孵化：胚体肌肉收缩增强，频率加快，尾部将卵膜顶起。并首先出膜，胚体继续扭动，最终完全出膜。反交鲆初孵仔鱼为畸形，表现为脊柱扭曲，孵化后不久（时间）全部死亡（图7），其余各组均可正常孵化。孵化前胚体绕卵长度在不同的组合中有所不同。牙鲆胚体绕卵80%～85%；夏鲆胚体绕卵105%～110%；正交鲆胚体绕卵100%；反交鲆胚体绕卵90%～95%；回交牙鲆，胚体绕卵75%；回交夏鲆，胚体绕卵90%～95%（图8）。

图7　反交鲆异常胚胎及初孵仔鱼

1，2，3：卵裂期异常胚胎；4：异常初孵仔鱼

图8　各组合孵化前的形态

1：牙鲆，胚体绕卵80%～85%；2：夏鲆，胚体绕卵105%～110%；3：正交鲆，胚体绕卵100%；4：反交鲆，胚体绕卵90%～95%；5：回交牙鲆，胚体绕卵75%；6：回交夏鲆，胚体绕卵90%～95%。标尺为300μm．

由于各组实验进行的时间不同，因此受精卵培育水温有所差别。牙鲆、正交鲆及两组回交鲆培育水温为18．0±0．5℃，夏鲆及反交鲆培育水温为16．5±0．5℃。在孵化水温18．0±0．5℃下，初孵仔鱼破膜用时为：牙鲆41h，正交鲆47h，回交牙鲆42h30min，回交夏鲆44 h。孵化水温16．5±0．5℃下，夏鲆61h40min，反交鲆66h。具体发育时间和发育阶段如表2所示。

表2　牙鲆与夏鲆正反交及回交胚胎发育时序的比较

2．4．3　六组组合仔稚幼鱼期色素变化

反交鲆在孵化后四天全部死亡，本实验对反交鲆色素的观察即截止到死亡前。由于实验条件所限，未对夏鲆仔稚鱼进行培养，本研究所用夏鲆数据引自Martinez（2003）对夏鲆的研究结果。

六组组合（牙鲆、夏鲆、正交鲆、反交鲆、回交牙鲆及回交夏鲆）色素的形态及分布在仔稚鱼时期有明显的不同。可分为两种主要的色素类型。

牙鲆、反交鲆以及回交牙鲆有着相似的色素分布模式（图9）。仔鱼期色素成点状，分布在躯干及卵黄囊上。点状色素的数量随着仔鱼发育而逐渐增多。在前期仔鱼期（孵化后1～4天），色素主要集中在腹鳍膜的中部以及背鳍膜前端及后端1／3处。在孵化后5～18天的后期仔鱼阶段，色素逐渐分布到整个背鳍膜及腹鳍膜上。背鳍膜较腹鳍膜颜色更深。头部的色素点在孵化后十天有着显著增加。在孵化后19～30天的后期仔鱼阶段以及31～40天的变态阶段，色素几乎布满了整个身体。

夏鲆、正交鲆以及回交夏鲆有相似的色素分布模式（图10）。对刚孵化的仔鱼来说，色素呈树枝状并分布在头部、卵黄囊以及背鳍膜和腹鳍膜的中线上。约两天后，分布在背鳍膜和腹鳍膜边缘的色素增多，但鳍膜后半部的色素很少。对孵化后5～18天的后期仔鱼来说，色素细胞发育较快且较规则地分布在从脊索前端到肛门的背腹鳍膜的边缘和中线处。在19～30天的后期仔鱼阶段，以及31～40天的变态期，色素在这三种组合中除了在尾鳍部位外，变得更加密集。到幼鱼期，上述各组合中色素的差异变得越来越不明显。

六组组合的仔鱼均可孵化，但反交鲆孵化后身体畸形，开口前全部死亡。回交牙鲆从1～15日龄各生长参数与其他三组没有明显差别，从15日龄开始，直至18日龄生长日渐缓慢，并最终死亡。

图9　牙鲆与回交牙鲆的色素模式

A：牙鲆；B：回交牙鲆．A1，A2，B1，B2：前期仔鱼（1～4dph）．A3，B3：后期仔鱼（5～18dph）．A4：后期仔鱼（19～30dph），A5：变态期（31～40dph）．标尺代表1mm．

图10　夏鲆、正交鲆和回交夏鲆的色素模式

A：夏鲆．A2～A5引自Martinez（2003）；B：正交鲆；C：回交夏鲆．A1，B1，C1：1dph．A2，B2，C2：3dph．A3，B3，C3：后期仔鱼（5～18dph）．B4，C4：后期仔鱼（19～30dph），B5，C5：变态期（31～40dph）．标尺代表1mm．

2．4．4　六组组合早期生长比较

我们对正交鲆、回交夏鲆的仔稚幼鱼生长进行测量并与牙鲆作了比较。初孵仔鱼经过64日的生长，正交鲆平均全长达到19．28cm，体长16．17cm，体高7．62cm，肛前长6．54 cm；回交夏鲆全长21．35cm，体长17．54cm，体高8．04cm，肛前长6．80cm；牙鲆平均全长21．87cm，体长19．11cm，体高8．97cm，肛前长8．38cm。直至64日龄，三个组合的生长情况并未见明显差别。

正交鲆、回交夏鲆及牙鲆的全长与体长增幅比较平稳，从初孵仔鱼到64日龄平均日增长率分别为27．20%和23．26%。体高和肛前长的增长明显分为三个阶段，体高的变化从初孵仔鱼到22日龄为缓慢增长期，平均增长率为6．17%；22～28日龄为快速增长期，平均增长率为62．17%；28～64日龄涨幅变慢，平均增长率为7．57%。肛前长从初孵仔鱼到22日龄为缓慢增长期，平均增长率为8．67%，22～28日龄为快速增长期，平均增长率为44．44%，28～64日龄涨幅变慢，平均增长率为3．80%。体长／体高经历了先缓慢下降，再快速下降，再趋向平稳的过程。第一个拐点出现在19天（全长／体高均值为5．6），表明19天之前体高比体长生长稍快，而后体高生长迅速加快，26天前后是全长／体高的第二个拐点（均值1．95），此后全长／体高相对稳定。体长／肛前长经历了平稳期，快速下降以及缓慢上升三个阶段。第一个拐点出现在22天（体长／肛前长均值为2．59），表明22天以前体长与肛前长增长速度一致，之后肛前长生长速度加快，26天前后为体长／肛前长的第二个拐点（均值1．75），此后体长／肛前长缓慢增长，表明26天后肛门后的躯干部生长开始加快。

2．5　18S、5SrDNA及端粒序列在牙鲆、夏鲆及正反交子代染色体上的定位

牙鲆中，18SrDNA在一中期分裂相染色体上获得两簇FISH信号；核型分析结果得知18SrDNA位于第七对端部着丝粒染色体的着丝粒区域。夏鲆中，以18SrDNA作为探针进行荧光原位杂交后在中期分裂相上可以检测到两簇信号。中期分裂相经过核型分析后证明夏鲆的18SrDNA分别位于八对染色体的长臂中部。

正交鲆中，18SrDNA探针在中期分裂相上可以检测到两簇信号。经过核型分析确定为第4对染色体的近着丝粒位置处。反交鲆中，18SrDNA探针在中期分裂相上可以检测到两簇信号。经过核型分析确定为第12对粒染色体的着丝粒位置处。

18SrDNA的探针在牙鲆、夏鲆及正反交子代中位于不同的染色体上，可以用来鉴定不同的杂种子代。另外一个比较有趣的现象是，除反交鲆外，信号的强度在牙鲆、夏鲆及正交鲆的同源染色体之间有差异，表现为在一条染色体上的信号比在同源的另一条染色体上的信号相对强。

2．5．1　5SrDNA在牙鲆、夏鲆及其正反交子代染色体上的定位

牙鲆中，5SrDNA探针通过FISH产生了两簇信号，经过核型分析确定为第1对染色体的着丝粒位置。夏鲆中，5SrDNA探针通过FISH产生了两簇信号，经过核型分析确定为第16对染色体的着丝粒位置。正交鲆中，5SrDNA探针通过FISH产生了两簇信号，经过核型分析确定为第12对染色体的着丝粒位置。反交鲆中，5SrDNA探针通过FISH产生了两簇信号，经过核型分析确定为第1对染色体的着丝粒位置。

5SrDNA的探针在牙鲆、夏鲆及正反交子代中的信号均位于染色体的着丝粒位置。在反交鲆与牙鲆染色体中的信号位于第一对染色体的着丝粒位置，表现出明显的父系遗传现象，而正交鲆中并未出现此类现象，而是与父母本都有明显不同。且牙鲆与反交鲆的两簇信号的强度在同源染色体之间有差异，而夏鲆及正交鲆的同源染色体之间的信号差异不明显。2．5．2　端粒在牙鲆、夏鲆及其正反交子代染色体上的定位

在本实验所设计的杂交及洗脱条件下，脊椎动物端粒序列（TTAGGG）n在所研究牙鲆、夏鲆、正交鲆和反交鲆的中期染色体上都出现较强的红色荧光信号。荧光信号分布在染色体的端部区域，信号强度有所差异，这种差异既表现在同一条染色体的两条姊妹染色单体之间，也表现在不同的染色体之间。有些染色体端粒区域信号非常弱，几乎不可见。

2.6　大菱鲆生殖系vasa／dnd基因克隆及RT－PCR半定量表达分析

vasa／dnd是生殖系相关基因，对于研究生殖细胞的发生和分化具有重要的作用。本实验通过同源克隆得到部分片段，再根据此片段设计基因特异性引物进行5′，3′Race获得基因全长。设计基因特异性引物进行半定量RT－PCR以分析其组织表达情况。克隆到的大菱鲆vasa基因全长2　125bp，开放阅读框1　896bp，编码631个氨基酸，具有Dead－box家族10个保守结构域，序列比对发现该基因编码的氨基酸序列与其他物种VASA蛋白具有较高的同源。克隆到的dnd基因全长1　508bp，开放阅读框1　203bp，编码400个氨基酸，拥有RRM（RNA识别位点）等5个保守结构域，序列比对分析表明与其他物种的DND蛋白具有较高同源性。RT－PCR半定量分析表明，vasa基因在大菱鲆雌雄性腺中特异表达，其他组织几乎没表达；同样dnd基因也在雌雄性腺中有大量表达，卵巢表达量高于精巢，此外脑中也有少量表达。

大菱鲆vasa在雌雄性腺中特异且大量的表达，这与已报道的物种相似，说明了其功能的高度保守；先前有报道dnd在成体性腺中的表达有性别差异，在爪蟾中仅限于卵巢表达，小鼠中dnd1a仅在精巢中表达，而在青鳉中两性都有表达，且表达量无明显差异。本研究发现在大菱鲆中雌雄均有表达，但精巢表达量明显低于卵巢，同时在脑中也有少量表达，因此其可能与性别分化有关，需要进一步研究。综上，vasa和dnd的克隆及雌雄性腺中表达的研究对于今后原位杂交、免疫组化以追踪原始生殖细胞起源迁移和分化提供了基础，具有重要的意义。

2．7　鲆鲽鱼类精子冷冻保存研究

2011年度完成大菱鲆大容量冷冻精子50mL，石鲽大容量冷冻精子10mL。并对大菱鲆冻精生理活性、结构及功能进行了以下分析研究。除了对冻精生理活性的检测外，我们又对冻精膜结构及功能进行了研究。采主要采用JC－1对精子的膜电位高低进行了检测，采用流式细胞仪荧光双染色对冻精的线粒体的结构、质膜结构进行了分析，采用荧光显微镜对冻精的显微结构进行了观察。

图11　精子流式细胞仪的检测结果

（岗位专家　李军）