雌核发育二倍体成功的例子

2　结果与分析

2．1　真鲷冷冻精子UV灭活

本研究发现，随着紫外线照射时间的延长，受精卵的孵化率表现出典型的哈特维希（Hertwig）效应（图1）。对照组的孵化率为69±3．5%，随着照射时间的增加，孵化率呈下降趋势，10s时降到最低值（2．0±0．1）%。然而随照射时间的继续增加，胚胎孵化率却缓慢上升，并在40s时出现第二个峰值，孵化率达（29±1．9）%，80s时孵化率重新回落为0。80s时受精率仅为（15±1．2）%，受精卵在原肠期陆续死亡，仔鱼无法孵化出膜。结果显示真鲷精液最佳UV灭活时间为40s，经紫外辐射计（VLX－3W）测量时间模式下的UV剂量为1　800μw／cm²，总照射剂量为72mJ／cm²。倍性鉴定显示，此剂量组孵化仔鱼均为单倍体（n＝24）。

图1　紫外线照射时间与受精率和孵化率的关系Fig．1 Relationship among UV irradiation duration，fertilization rate and hatching rate

2．2　冷休克诱导雌核发育二倍体发育

本研究中，在0～2℃条件下，冷休克起始处理时刻3min、持续时间45min时，受精率为37．2±5．1%，孵化率为9．4±0．71%，畸形率为8．3±2．5%（表1）。初孵仔鱼经倍性鉴定，均为二倍体（2n＝48），未发现单倍体和非整倍体。在冷休克处理过程中，随着冷休克起始时刻延后及处理时长的增加，胚胎发育畸形率呈先下降后缓慢上升的趋势。起始时刻分别为1 min、5min时的仔鱼孵化率与3min的仔鱼孵化率无显著差异（P＞0．05），但其畸形率差异显著（P＜0．05），1min和5min的畸形率分别为27．7±3．2%和21．3±1．9%（图2）；持续时间30min和45min时受精卵孵化率差异不显著（P＞0．05），但初孵仔鱼畸形率前者明显高于后者；随着冷休克持续时间的增加，受精率在45min时达到最大（37．2±5．1%）后继续下降，90min时受精率仅为10．4±1．9%，孵化率为1．8±0．21%（图3）。

图2　冷休克起始时刻对雌核发育二倍体仔鱼孵化率和畸形率的影响Fig．2 Effects of initial moment of cold shock on hatching rate and malformation rate of gynogenetic diploid larvae

图3　冷休克处理持续时间对雌核发育二倍体孵化率和畸形率的影响Fig．3 Effects of cold shock duration on hatching rate and malformation rate of gynogenetic diploid larvae

表1　漠斑牙鲆冷休克梯度试验结果Tab．1 Results from cold shock duration experiment in gynogenesis induction of Paralichthys Lethostigma

TA：冷休克处理起始时刻；D：冷休克处理时间．

TA：Treatment initial time after fertilization；D：Duration time．

2．3　倍性检测

流式细胞仪检测结果显示：雌核发育二倍体仔鱼DNA含量和正常二倍体DNA相对含量相同。单倍体仔鱼头小，卵黄囊大，眼径短，身体短小并严重扭曲，仔鱼尾部发育不完全，表现出典型的单倍体综合征，与正常二倍体仔鱼和雌核发育二倍体仔鱼相比，在体长、卵黄囊长上存在显著差异（P＜0．05）（表2），36h内全部死亡。染色体观察结果同样表明单倍体的染色体数目n＝24，雌核发育二倍体的染色体数目2n＝48，与正常漠斑牙鲆染色体数目相同［20］（图4）。

表2　正常二倍体、雌核发育二倍体和单倍体1日龄仔鱼的几个形态指标比较Tab．2 Comparison of morphological index among haploid，gynogenetic diploid and normal fry of southern flounder

图4　漠斑牙鲆单倍体、雌核发育二倍体和正常二倍仔鱼形态及染色体图片

a．b：单倍体；c：正常二倍体；d：雌核发育二倍体；e：单倍体染色体核型；f：雌核发育二倍体染色体核型

Fig．4 Morphological characteristics and chromosome karyotype of haploid larvae，

Gynogentic diploid larvae，normal diploid larvae of Paralichthys Lethostigma

a．b：Haploid larvae；c：Normal diploid larvae；d：Gynogentic diploid larvae；e：Chromosome karyotype made from hapiloid embryo；f：Chromosome karyotype made from Gynogentic diploid larvae

2．4　单倍体、雌核发育二倍体及正常二倍体胚胎发育特征

在温度19±0．5℃，pH8．0～8．2，盐度28～32，DO≥6mg／L孵化条件下，雌核发育二倍体组和单倍体组胚胎发育时间依次为64h59min、55h49min与正常组（49h45min）发育时间差异显著（P＜0．05）。漠斑牙鲆胚胎发育各时期的划分参考马学坤等［21］的相关报道，单倍体组、雌核发育二倍体组和正常二倍体组胚胎发育时序见表3，各组发育形态特征见图5。2．4．1　卵裂期

受精卵在胚盘形成后经5次径裂、1次纬裂在动物极形成表面粗糙的圆帽状细胞群，进入桑葚期（图A、B、C、D、E、G、H）。该阶段，单倍体组在32细胞期时，畸形率明显上升，细胞大小不均，整个受精卵呈花簇状（图F3）；雌核发育二倍体组和正常二倍体组在发育时序和形态特征方面类似（图F1），发育速度由高到低依次为：单倍体组、雌核发育二倍体组、正常二倍体组。

2．4．2　囊胚期

随着动物极细胞的增殖，高囊胚形成；囊胚细胞的不断分裂使囊胚层边缘变薄进入低囊胚期。该期，单倍体组的囊胚冒较小，细胞界限模糊，发育速度与卵裂期相同（图I1、I2、I3）。

2．4．3　原肠期

正常二倍体组胚胎在受精后14h33min原肠腔形成（图J1、J2、J3），原肠中期时胚盾明显，胚体雏形出现（图K1、K2）；随着胚体的不断延伸，胚盾前端膨大发育至原肠晚期（图L1、L2）。该期，单倍体组胚环上部出现一明显发黄带，不透明（图K3）；胚环、胚盾形状略显不规则，胚环表面凹凸，较单薄，胚体也无正常组清晰（图L3）。在进入原肠早期时，同雌核发育二倍体（1h56min）和正常二倍相比（1h21min），单倍体组发育速度明显迟缓历时长达3h3 min。该期胚胎发育速度由高到低依次为：正常二倍体组、单倍体组、雌核发育二倍体组。

2．4．4　神经胚期

胚盘下包至4／5，神经板形成；原口关闭后，胚盾中部出现不规则肌节，正常组、雌核组胚体的头部充实、明显（图M1），而单倍体胚体胚体模糊、粗短，畸形胚体较多（图M3）。该期胚胎发育速度由高到低依次为：正常二倍体组、雌核发育二倍体组、单倍体组。

2．4．5　器官发生期

眼泡期正常二倍体组眼部轮廓明晰，形态上雌核发育二倍体组与其类似（图N1、N2）；单倍体组的眼泡模糊，胚体头部粗大、不规则，体节界限不清（图N3）。胚体发育至绕卵黄囊2／5时，其末端出现一透明的小泡，即克式泡（图O1、O2）；单倍体组克式泡大小不均，分布杂乱（图O3）。胚体绕卵黄囊3／5时，视囊内晶体可辨认，听囊和脑逐渐形成，此期暂未见心脏跳动，但胚体尾部开始发生扭转（图P1、P2、P3）。该期3组胚胎发育时间差异明显，雌核发育二倍体组和单倍体组相对正常二倍体组胚胎发育分别滞后8h58min和6h3min，发育速度由高到低依次为：正常二倍体组、单倍体组、雌核发育二倍体组。

2．4．6　肌肉效应期

胚体绕卵黄囊4／5时，克式泡消失，胚体出现间断性肌肉效应，频率10～15次／min；正常二倍体组和雌核发育二倍体组心跳频率60～70次／min（图Q1、Q2），单倍体组胚体粗短，心跳频率偏慢（45～55次／min），肌肉效应不明显（图Q3）。

2．4．7　脱膜孵化

胚体绕卵黄囊一周，胚体收缩幅度和频率加大，以先头部后尾部的出膜方式出膜（图R1、R2）；单倍体组由于尾部严重畸形，卵黄囊大等特点，出膜困难，相对正常二倍体组整个出膜时间滞后了1h3min（图R3）。雌核发育二倍体组初孵仔鱼形态与正常二倍体仔鱼无显著差异（图S1、S2）；单倍体组仔鱼全部畸形，呈典型单倍体综合征（图S3）。

表3　漠斑牙鲆单倍体、雌核发育二倍体及正常二倍体组各发育时序（孵化水温19±0．5℃）Tab．3 Embryonic development of haploid，gynogenetic diploid，and normal diploid Paralichthys Lethostigma at temperature of（19±0．5）℃

（续表）

2．5　实验组初孵仔鱼受精率、孵化率和畸形率统计

本研究表明：冷冻真鲷精子可以成功诱导漠斑牙鲆减数分裂雌核发育二倍体，雌核发育二倍体组经冷休克处理后受精率和孵化率明显下降，与正常二倍体组和单倍体组的受精率和孵化率差异显著（P＜0．05）；单倍体组和正常二倍体组受精率差异不明显（P＞0．05），但孵化率仅为29．0±1．9%，单倍体组初孵仔鱼全部畸形，表现出典型的单倍体综合征（表4）。

图5　漠斑牙鲆正常二倍体（A～H，I1～S1）、雌核发育二倍体（I2～S2）和单倍体（F3，I3～S3）胚胎发育特征比较

A．受精卵；B—2细胞期；C—4细胞期；D—8细胞期；E—16细胞期；F1—32细胞期；F3—32细胞期，箭头示花状畸形细胞；G—128细胞期；H—桑葚期；I1～I3—高囊胚期，箭头示高囊胚；J1～J3—原肠早期，箭头示胚环；K1～K3—原肠中期，箭头示死亡细胞；L1～L3—原肠后期，箭头示凹凸不平的胚环；M1、M3—神经胚期；N1～N3—眼泡形成期，箭头示眼泡；O1～O3—克式泡期，箭头示克式泡；P1～P3—晶体期，箭头示尾部严重畸形的胚体；Q1～Q3—肌肉效应期，箭头示畸形胚体；R1～R3—出膜前期；S1～S3—初孵仔鱼

Fig．5 Comparison of morphological characteristics of embryonic development of normal diploid（A～H，

I1～S1），gynogenetic diploid（I2～S2）and haploid（F3，I3～S3）Paralichthys lethostigma

A—Fertilized egg；B—2cell stage；C—4cell stage；D—8cell stage；E—16cell stage；F1—32cell stage；F3—32cell stage Flower teratocytes；G—128cell stage；H—morula stage；I1～I3—high blastula stage，High blastocyst；J1～J3—early gastrula stage，Germ ring；K1～K3—mid gastrula stage，Dead cells；L1～L3—Telo—phase of gastrulastage；M1、M3—neurula stage；N1～N3—formation of optic vesi－cle；O1～O3—Kuppefs vesicle stage；P1～P3—formation of eye lens；Q1～Q3—muscular contraction，Ab－normal embryo；R1～R3—Hatching out；S1～S3—newly－hatched larva

表4　各组受精率、孵化率和初孵仔鱼畸形率统计Tab．4 Fertilization rate，hatching rate and malformation rate of newly hatched larvae in each group