清洁的环境

9.3　清洁的环境

清洁的环境对制种是绝对必需的，特别是打开灭菌培养基容器时，必须在无菌条件下操作。空气中有很多杂菌，很容易感染灭菌后的培养基。你很难想象空气中的颗粒有多少，典型的干净沙漠中的空气每立方英尺含有200,000个颗粒（3,800,000个/立方米），在工业区这个数字增加10倍，一个吸烟的人就可使室内颗粒数增加100倍。并非所有颗粒都对菇菌菌种有害，如含有泥土、硅石或腐烂有机质的颗粒就无害，各种微生物孢子却对无菌培养基构成威胁。多数孢子大小为0.4～20微米，也会附着在空气中较大的颗粒上，只有病毒小得多，为0.05微米，但通常附着在较大的颗粒上。

接种箱

要创造完全无菌的环境几乎是不可能的，只要污染程度控制在一定水平之下，环境的无菌条件就足够了。工业化国家制种厂家容忍的污染程度极低，而在热带国家（资源有限，感染压力大）合理的污染率为5%。这里介绍创造干净接种区的三个方法：

●小规模制种，用简单接种箱

●中等规模制种，用平流接种箱

●如果资金充足，预计产量大，就建干净接种房间

9.3.1　接种箱

整个东南亚广泛使用这种简单的接种箱，可用当地能买到的材料制作，成本低，前面的玻璃可打开，将灭菌培养基装入箱中。箱内用70%酒精及10%次氯酸钠溶液消毒，灭菌的另一种方法是在福尔马林溶液中添加高锰酸钾，气体将使接种箱里面彻底灭菌。使用这些化学物质时要注意，如福尔马林有毒，可能致癌（在10℃以上，有足够新鲜空气时，12小时内就会分解）。

除了使用化学物质外，还可使用紫外线灯照射灭菌，紫外线灯的短波射线可杀死多数孢子，但将紫外线灯安装在室内不产生阴影的位置却很难。一旦开始工作，就要将灯关掉，否则长期使用，紫外线灯可能引起皮肤癌。仅在接种箱内部灭菌是不够的，直接的环境也必须保持绝对干净，地面及墙壁最好用水泥浇筑。

一个现成的平流接种箱

9.3.2　平流接种箱

平流接种箱由风扇、管道、过滤器及平流排气罩组成。平流箱的优点是杂菌只能向一个方向扩散，而在湍流空气中，孢子可能向各个方向流动，从而引起更多污染。多数情况下，平流接种箱就足够了。过滤器大小必须与高压风扇匹配。换气扇的速度，由厂家根据它能吹过一定阻力的材料的空气量来确定，0.45米/秒的空气速度对产生好的平流空气最适宜。风扇应该能够将足量的空气吹过过滤器，以达到所需流速。事实上，风扇功率应该大些，以弥补压力损失及过滤器中有颗粒时增加的静态压力。HEPA（高效微粒空气）过滤器阻力加倍时，就要更换。如果安装预过滤器，高效微粒空气过滤器使用年限一般与整套干净房间一样长，想办法用壁炉过滤器作为预过滤器：一般比较便宜，各种型号在西方国家也容易买到，一块简单的布也可用作预过滤器。

高效微粒空气过滤器的初始阻力大，因此，过滤器前面的压力将大大增加。过滤器要非常密封地嵌合在平流室中，否则，不纯净的空气就会通过密封不严的缝隙吹入到传播的气流中。

过滤器的效率是衡量过滤器清除一定大小的颗粒效果的一个指标，如果一个过滤器中标明对0.3微米的颗粒过滤效率为99.99%，那么10,000个这么大的颗粒中只有一个可以通过，这是高效微粒空气过滤器的典型效率。甚至还有效率更高的过滤器，如ULPA（超低穿透空气）：99.999%，VHSI：99.9995%，MEGA：99.99995%。

一般来说，高效微粒空气过滤器就足够了，但有些平流接种箱含有ULPA过滤器。过滤器是任何平流系统的心脏，但其他因素也应考虑：操作员及其卫生情况，管道及过滤器的建造方式应该阻止任何不纯空气被吸入。也可以买现成的平流接种箱，优点是已进行查漏检测，因此，肯定能提供干净空气，缺点是价格比自己做的平流接种箱高得多。

9.3.3　干净房间

如果要接种大量的菌种或培养料，就可以选择建一个完全干净的房间，采用一个开放的压力通风系统或单独设计的管道系统。平流屋顶能有效地保持低污染水平：工人鞋子上的孢子留在地上扫出去，不会与灭菌的培养基接触。这种房间的空气，一般每小时交换10～20次，高压将阻止杂菌进入，特别是如果建造了缓冲间作为屏障的话。具体设计，请咨询过滤器供应厂家。在房间里比在箱子里更难实现真正的空气平流。如果将最干净的空气引入到工作场所，非平流空气干净房间也行。非平流空气干净房间的空气流速，必须保持在0.15～0.45米/秒之间，流速低，使杂菌容易扩散，流速高，湍流空气会形成死角而使杂菌积聚。

干净房间的设计：气流由塑料薄膜引导

9.3.4　养菌室

接种后的培养料必须养菌，谷粒菌种养菌时间约为2周，锯末菌种为2个月。少量的菌种、斜面或培养皿，可放在恒温箱中培养，这种恒温箱保持温度恒定，更贵的还可以调节二氧化碳浓度，主要优点是容易控制。要生产大量菌种时，必须建造养菌室。

9.3.5　养菌室的设计

养菌室内部应当用非生物降解材料建造，各处表面必须平整，容易清扫。如果要涂漆，最好用不长霉的瓷釉，不要使用含杀菌剂的漆，因为这种漆通常毒性很强。养菌必须保持恒温，因此，养菌室隔热性能要好。

床架的设计应该使其下面的地板容易清扫，典型的床架用白铁皮或胶木建造。如果使用大的菌种容器，床架应当开放，以便更容易驱散产生的热量，也可以把菌种容器放在推车上，这样只需把推车从干净房间（装料的地方）推到养菌室。一旦菌丝体长满整个培养料，就要对菌种容器进行检查和包装，然后将菌种放在冷藏室保存，直至装运。养菌室大小当然取决于预计容量，容量又取决于养菌时间及可利用的表面积（床架或推车）。如果菌袋分开放，每平方米可放约60千克（或90升）菌种，菌种袋/瓶的大小和类型，决定每平方米能放培养料的确切数量。

例如：如果有面积各为5平方米的床架8个，那么每周可在养菌室放450升锯末培养料（养菌时间为8周），如果生产养菌时间为2周的谷粒培养料，那么同一养菌室每周可放1,800升培养料。

9.3.6　养菌室的气候条件

温度：养菌过程中，要考虑的主要气候因素是温度。大的菌种容器内（如5升或10升）温度要高于室温，那么温度计设定的温度就要比菌丝体最适宜生长的温度低几度。如果使用小容器，如1升的瓶子或袋子，那么室温与菌种容器内温度几乎一样。

恒温将防止水凝结在培养皿盖子上或菌种容器内，冷凝水可能把休眠的杂菌孢子带到营养丰富的培养基中，污染培养基，细菌特别喜欢冷凝水。

二氧化碳浓度：应当适当通风，避免大气中二氧化碳浓度超过1,000×10^-6。如果养菌室放满了接种后的培养料，菌丝体会产生大量的二氧化碳，袋子/瓶子内二氧化碳浓度可高达20,000～40,000×10^-6，随着生长的菌丝体减少，二氧化碳浓度不应超过50,000×10^-6。

湿度：菌种容器内的湿度应当足够大，以防止上层培养料干燥，菌种容器的设计对湿度的影响比房间内湿度的影响大。室内湿度要低（相对湿度为30%～50%）以避免潮湿，因为潮湿条件下杂菌会萌发。