烟草漂浮育苗中的快速检测方法

五、烟草漂浮育苗中TMV的快速检测方法

烟草漂浮育苗中烟草花叶病毒（TMV）快速检测是防治烟草病毒病技术体系——“四步法”中的第二步，即在第一步狠抓漂浮育苗的消毒等预防工作后，要求做好漂浮育苗病毒病的快速检测工作。TMV快速检测技术的步骤和方法如下：

1.漂浮苗随机采样方法

漂浮育苗采样原则是，重点采样检测与普遍采样检测相结合，全州确立147个大棚群作普遍采样检测；对200个以上供2万亩以上大田移栽的大棚育苗点作重点采样检测；对1000个以上供4000亩以上大田移栽的小棚育苗点作重点采样检测，历史上发生花叶病的棚群作重点检测；上年发生花叶病的棚群作重点检测；对发生疑似症状的育苗棚作重点检测。

2.大棚群采样方法

大棚群根据要求随机选取取样棚，确定为取样棚后对每个育苗池烟苗进行取样，池内采用“S”形五点随机取样法取样，每池（200盘容量以上）随机选取30盘烟苗，每盘取1个叶片（约一个大拇指大小），10个叶片装入一个样品袋，作为一个混合样进行检测，即每池取3个混合样本进行检测；每池（100～200盘容量）随机选取20盘烟苗，每盘取1个叶片（约一个大拇指大小），10个叶片装入一个样品袋，作为一个混合样进行检测，即每池取2个混合样本进行检测；每池（100盘容量以下）随机选取10盘烟苗，每盘取1个叶片（约一个大拇指大小），10个叶片装入一个样品袋，作为一个混合样进行检测，即每池取1个混合样本进行检测。操作方法如示意图6-1，2。

图6-1　育苗池内样品采集示意图

图6-2　育苗小棚群样品采集示意图

3.小棚群采样方法

小棚群以区（10～20个小棚为一个区）取样单位，采用“S”形五点随机取样法进行取样。确定为取样小棚的以棚为取样单位，每个小棚内随机选取10个苗盘，每盘取1个叶片（约一个大拇指大小），10个叶片装入一个样品袋，作为一个混合样进行检测，即每棚取1个混合样本进行检测。以后每次采样均要以第一次采集棚池为准，样品采集如示意图2。

4.取样方法、样品编号规范及样品装袋规范

每株烟苗取4 cm²～5cm²（约拇指第一节大小）的叶片。因样品量较大，为使检测能顺利进行，检测采用统一样品编号，例如：祥云县禾甸乡3号棚1号池4月18日采样，编号为XY～HD～3～1～418。检测采用统一样品装袋，如示意图6-3。

图6-3　样品装袋意图

5.采样注意事项

进入棚群必须用一次性塑料脚套（或塑料袋套脚），每采集完一个育苗池采集人员更换一次性手套（或洗手），同时要换一次性塑料脚套（或塑料袋），防止人为造成病毒传播；在第一次采样后，育苗池之间的苗盘不能交换，以便于检测及分析最终试验数据；建立取样档案，要包括大棚和育苗池分布示意图及育苗池编号。

6.样品处理流程

采集的样品按照图3的流程进行分类、检测。各县样品经统计整理后，先进行TAS～ELISA检测。检测结果为阳性的样品继续进行电镜负染法复检，阴性样品抽取1%～5%的进行电镜负染法复检，最后分析得出检测报告。操作流程如图6-4。

图6-4　样品检测流程图

7.检测方法

（1）电镜负染色法

参照张仲凯等的方法进行待测样品徒手切片粗汁液2%钼酸铵（pH5.5）负染色，置于JEM100CX～Ⅱ型透射电子显微镜观察至少30个视野以上，判定样品中病毒相对含量。

（2）TAS～ELISA法

TAS～ELISA流程操作如下：

①TMV多抗血清（1:5000）加入酶标板（包被缓冲液稀释），每孔100μl，37℃下放置2～3小时。

②PBST洗板3次，3 min/次，拍干。

③样品加入病毒抽提缓冲液（约5～10倍）研磨样品，加入酶标板，每孔100μl，4℃下放置过夜或37℃ 2小时。同上洗板。

④每孔加入200μl封闭缓冲液，37℃下放置30min。抛弃孔中液体，拍干。

⑤TMV单克隆抗体（1:10000）（PBST稀释），加入酶标板，每孔100μl，37℃下放置1～2小时。同上洗板。

⑥羊抗鼠AP～IgG（1:10000）（PBST稀释），加入酶标板，每孔100μl，37℃下放置1小时。同上洗板。

⑦用底物缓冲液溶解底物（1mg/ml），加入酶标板，每孔100μl，室温（25℃）下至充分显色（每孔加入50μl 1N NaOH终止显色）。肉眼判别或酶标仪读数。

8.检测结果处理

（1）检测结果分类标准

应用酶标仪进行检测结果判别时，记录酶标仪在405nm波长下酶标板每孔的OD数值，首先进行空白孔系统调零，若空白孔出现明显的颜色反应，或经空白孔调零后，系统检测出现大量的负值时，整个系统测定无效；每一样品测定双孔的OD值应基本一致，若两孔测定值差别较大（一般指同一样品相同稀释度两孔的OD值超过其均值的0.5～1.5倍范围），该酶标板检测结果无效。若阳性对照OD值低于或接近阴性对照OD值时，测定也无效。待测样品OD值与阴性对照OD值检测之比大于等于3时，待测样品为强阳性，大于2时为阳性，小于2而大于1.8时为弱阳性，小于1.8而大于1.5时为疑似样品，小于1.5为阴性。

对照电镜检测结果，大田实际发病情况可以进一步确定各等级带毒情况为：“疑似”表示检测样品中最多有一个叶片初期感染病毒，但电镜负染检测未能观察到典型病毒粒子，或者是由于取样及检测的误差出现为OD值偏高；“弱阳性”表示检测样品中有1～2个叶片初期感染病毒，但电镜负染检测30个视野可以观察到1～2个疑似病毒粒子；“阳性”表示检测样品中有1～2个叶片感染病毒，电镜负染检测30个视野可以观察到2～3个病毒粒子；“强阳性”表示检测样品中有3～4个叶片感染病毒，电镜负染检测30个视野，每个视野可以观察到2～3个病毒粒子。

（2）检出棚群的处理

疑似及弱阳性样品建议增加30倍取样规模进一步进行带毒率检测，确证后再确定烟苗使用与否；对于阳性样品要求重复采集5～10倍取样规模进行复测，确证后建议关闭棚池；对于强阳性样品，通过细致调查棚池的显症带毒情况，建议关闭棚池。