菌种生产技术

（二）菌种生产技术

1.菌种类型与分级

菌种生产是栽培食用菌的中心环节。没有菌种便不能进行食用菌的人工栽培，没有优良菌种就不能获得优质高产的食用菌。因此，掌握菌种的制作技术，是食用菌生产不可忽视的重要环节。食用菌的菌种，根据其来源和生产目的，通常将它们分为母种、原种和栽培种三级。

（1）母种母种是一级种，它是生产其他菌种类型的原始种。母种一般以玻璃试管作为容器，通过孢子或组织分离培养获得，并经鉴定为种性优良、遗传和生理性状相对稳定的在试管斜面上生长和保存的纯菌丝体。母种转管扩大繁殖次数不宜过多，否则会降低菌种的生活力，影响产品质量。对于没有母种生产经验，缺乏母种质量鉴别能力的制种单位，尽量不进行一级种的生产。

（2）原种原种是二级种。是母种扩大到木屑或棉子壳等培养基培育的菌丝体，这是菌丝体和天然基质的混合体。必须保持菌种纯度，绝对不能有污染。

（3）栽培种栽培种是三级种。由原种转接在天然基质（培养基）上扩大繁殖而成的菌种。栽培种也是菌丝体和天然基质的混合体。栽培种常作为栽培用菌种或直接出菇。也有人称之为生产种。

2.食用菌菌种分离

菌种分离是菌种纯化的基本方法，是制种工作的首要环节。食用菌菌种分离，通常采用组织分离、孢子分离和菇木分离三种方法。

（1）组织分离法组织分离法就是指采用食用菌子实体或菌核、菌索的任何一部分组织，培养成纯菌丝体的方法。该方法属无性繁殖，简便易行，菌丝生长发育快，能保持原有性状。它是大多数食用菌进行菌种分离的最简便而又有效的方法，也是人们在野外分离菌种最常采用的简便方法。根据分离材料的不同，组织分离法又可分为子实体组织分离法、菌核组织分离法以及菌索分离法等。其中子实体组织分离法最常采用。

①子实体组织分离法它是采用子实体的任何一部分，如菌盖、菌柄、菌褶、菌肉进行组织培养而形成纯菌丝体的方法（图7）。制作技术与步骤如下：

第一，种菇的选择。选择头潮菇、外观典型、大小适中、菌肉肥厚、颜色正常、尚未散孢、无病虫害、长至七八分成熟的优质单朵菇作种菇。

第二，种菇的消毒。切取菇体基部，放入已消毒灭菌的接种箱或超净工作台上。用75%的酒精棉球擦拭子实体表面，以充分杀死种菇表面的杂菌。

第三，切块接种。用消过毒的解剖刀在菇柄与菇盖中部纵切一刀，撕开后再在菇柄与菇盖交接处的菌肉上，用刀划上一些口子，挑取0.2～0.5厘米见方的小块组织，接在斜面培养基的中央。一般一个菇体可以分离6～8支试管。一般每次接种在30支以上，以供挑选用。

第四，培养纯化。在适温下培养2～4天可看到组织块上长出白色绒毛状菌丝体，移接到新的培养基上，再经过5～7天的适温培养，长满试管后即为纯菌丝体菌种。

第五，出菇试验。将分离得到的试管种扩大繁殖，并移接培养成原种、栽培种，做出菇试验，选出出菇好、产量高、质量好的，即可作栽培生产用种。

②菌核组织分离法它是从食用菌菌核分离培养获得纯菌丝的一种方法。猪苓、茯苓、雷丸等食用兼药用菌，它们的子实体不易采集到，而它们的营养贮藏器官菌核则较易获得。菌核分离是把菌核表面洗净，放入经灭菌消毒的接种箱中或超净工作台上，用75%的酒精或0.1%的升汞溶液浸泡0.5～1分钟，用无菌水冲洗数次，再用无菌解剖刀把菌核从中切成两半，在中心位置挑取黄豆大的一小块组织，接在斜面培养基中央，在25℃下培养。当接种块萌发出菌丝后，挑取无杂菌、长势旺的菌丝体转管培养后即可作母种。

③菌索组织分离法它是从菌索中分离培养得到纯菌丝体的方法。如蜜环菌、假蜜环菌在人工培养条件下不易形成子实体，也不产生菌核，它们是以特殊结构的菌索来进行繁殖的，因此这类菌可采用菌索分离菌种。

图7　子实体组织分离法

菌索分离法具体做法为：将风干的菌索放入灭菌消毒过的接种箱中或超净工作台上，挑取生命力旺盛的菌索尖端部分，用75%的酒精棉球擦拭表面，以无菌的解剖刀除去菌索的黑色外皮层（即菌鞘），抽出其中白色菌髓部分，将其剪成小段，移接到培养基中央。在25℃左右的温度下培养，当菌丝生长出来后，经几次提纯转管后即可制成母种。

（2）菇木分离法它又被称为耳木分离法或寄主分离法，是从生长食用菌的菇木或耳木中获得纯菌丝体的方法。由于菌丝生长进入木材时，已经过了一次大自然的选择，一般已把分解纤维素、木质素能力弱的菌丝自然淘汰。因此菇木分离培养的菌种一般生活力都较强。木腐菌类的木耳、银耳、香菇、平菇等菌类都可以采用此法。在实际生产中，由于这种方法污染率高，所以能用组织分离或孢子分离获得菌种的菇类，一般都不采用此法。只有那些食用菌的孢子不易获得，菇体小而薄或有胶质者，组织分离较为困难时，才采用菇木分离法（图8）。

①菇木的选择在分离菌类的季节，选择子实体大而肥厚、颜色和形态正常、无病虫害、杂菌少、腐朽程度较轻的新鲜菇木或耳木作种木。

②菇木的消毒从种木上去掉子实体后，为了减少杂菌污染，在分离前，先把菇木通过酒精灯火焰，反复燎过数次，以烧死表皮上的杂菌孢子为好，再锯成1～2厘米厚的横断木块，除去树皮和无菌丝的心材部分，送入消毒灭菌过的接种箱或超净工作台上，将木片浸入0.1%的升汞溶液或75%的酒精溶液中浸泡1分钟，上下不断翻动，然后用无菌水冲洗3次。

③分离与培养把消毒过的菇木小木块放到无菌的纱布上，在下面垫上消过毒的木板，用无菌刀把小木块切成半根火柴杆大小的小条，截取两头，移接到培养基中央。在25℃左右的温度下培养2～3天，菇木小条上一般就会长出白色菌丝，再培养15天左右，菌丝就可长满斜面。最后从中挑选出生长发育良好的作为母种。

（3）孢子分离法孢子分离法是用食用菌成熟的有性孢子（担孢子或子囊孢子）萌发培养成菌丝体而得到菌种的方法。食用菌的有性孢子具备双亲的遗传特性，变异的机会多，生命力强，培育成的菌种质量好。有性孢子是选育优良新品种和杂交育种的好材料。双孢菇、草菇等同宗配合的菌类可采用单孢分离法；香菇、平菇、木耳等异宗配合的菌类应采用多孢子分离法，否则菌丝不育，培养成的菌丝体不能产生子实体，不能用作菌种。

孢子分离法的操作程序：选择种菇→种菇消毒→采收孢子→接种→培养→挑菌落→纯化菌种→母种。

①单孢分离法它主要用于单孢子的分离。为了从孢子中选优及杂交，就必须进行单孢分离。即在人工控制下，使两个优良品系的单孢子进行杂交，从而选育新的优质菌种。从许多孢子中挑出单个孢子，一般需要单孢子分离器。如果没有单孢子分离器，也可采用平板稀释法、连续稀释法、毛细管法获得单个孢子。

图8　菇木分离法

1.种木　2.切去外围部分　3.消毒　4.冲洗　5.切块　6.接入试管

②孢子印分离法取成熟的伞菌或胶质菌的子实体，经表面消毒，切去菌柄，菌褶向下，置于灭过菌的有色纸上（红、黑、蓝、白），用通气钟罩罩上，在20～24℃室温下静置24小时，大量孢子便落在灭过菌的纸上（白色孢子用黑纸），形成孢子印。再从孢子印上挑取少量孢子移入试管培养基上培养。

③孢子弹射分离法它是利用孢子能自动弹出子实体层的特性来收集并分离孢子。它是将整个成熟的种菇（如双孢菇、香菇、平菇、草菇等）经表面消毒后，插入孢子采集器（图9）内收集孢子。在无菌操作下，将孢子稀释成悬浮液，接种到马铃薯琼脂培养基上，萌发成纯菌丝体即菌种。

④空中孢子捕捉法伞菌的孢子（如平菇、香菇、金针菇等）大量弹射时，子实体周围可以看到“孢子云”，可在“孢子云”飘去的上方倒放琼脂平板，使孢子附在其上，再盖上皿盖，封好培养。整个过程动作尽可能要迅速敏捷。

图9　孢子采集器

1.包扎系口纱布　2.玻璃钟罩　3.种菇　4.支架　5.培养皿　6.搪瓷盘　7.纱布

⑤菌褶上涂抹法取成熟伞菌，切去菌柄基部，带入接种箱内，用75%酒精对菌盖、菌柄进行消毒，用接种环直接插入两片菌褶之间，轻轻地抹过褶片表面，然后用画线法涂抹于试管培养基上。操作上，只要注意勿使接种环抹到暴露在空间的菌褶部分，很容易获得成功。在野外采集时，人们常用此法分离孢子，从而获得菌种。

3.培养基的制作

食用菌属于异养型生物，必须由外界提供所需的养分，才能生存和生长。培养基是用人工方法，配制各种基质，供给食用菌生长繁殖所需的营养物质。就像栽培作物需要土壤和肥料一样，食用菌菌丝必须生长在合适的培养基上。所以制作食用菌菌种和栽培食用菌，都必须制备相应的培养基。

（1）母种培养基的制作食用菌母种的培养基和分离种时用的培养基，一般都制成斜面试管，因此又常称为斜面培养基。母种又称为斜面试管种。母种常用的培养基有马铃薯葡萄糖培养基、木屑浸出汁培养基、豆芽汁培养基、棉子壳煮汁培养基、子实体浸出液培养基、粪汁培养基、麦芽膏酵母膏培养基、稻草浸汁培养基、麦芽汁培养基、胡萝卜马铃薯培养基等。斜面培养基的制作步骤如下：

①按配比精确地称取各种营养物质。

②将去皮、挖掉芽眼的马铃薯切成小块（或胡萝卜、子实体、黄豆芽、棉子壳等）放入小锅或大烧杯中，加入一定量的水，用文火煮沸30分钟左右，过滤取汁；玉米粉（或高粱粉）加水后，一般加热至70℃左右，并保持60分钟，过滤取汁；麦芽则要加热至60～62℃，保持60分钟，过滤取汁。

③补足失水，加入琼脂，文火煮熔。

④加入需加的其他营养物质。

⑤充分搅拌均匀，并调pH。

⑥趁热分装。培养基的分装量应为试管长度的1/5，不能过多或过少。操作时应尽量防止培养基黏在试管口上，若已黏上，应用纱布或脱脂棉擦净（图10）。

图10　斜面培养基分装

⑦装好培养基的试管应及时塞上棉塞。棉塞要用未经脱脂的原棉。棉塞要大小均匀、松紧度适中，长度一般为4～5厘米。一般要求3/5留在试管内，其余2/5露在试管外面。

⑧把塞好棉塞的试管每7～10支捆扎成一把，用牛皮纸或双层报纸包住，再用皮套扎紧或棉线捆好，放入手提式高压锅中。

⑨采用高压蒸汽灭菌。把捆扎好的一把把试管直立于锅中，以免灭菌时弄湿棉塞。在1.0～1.1千克/平方厘米压力下灭菌30分钟。

灭菌完毕后，让其压力和温度自然降至零后，立即取出培养基，在清洁的台面或桌面上倾斜排放，摆成斜面，一般斜面长度以达到试管全长的1/2为宜。培养基冷至室温时，就自然凝固成斜面培养基（图11）。

⑩检查灭菌效果。必要时把斜面培养基放在28～30℃的条件下，培养24～48小时，检查有无杂菌污染。

（2）原种和栽培种培养基的制作原种的培养基与栽培种的培养基的配制基本相同，只不过原则上制作原种的培养基要更精细些，营养成分尽可能丰富，而且还要易于菌丝吸收，以便移接的母种菌丝更好地生长发育。由于原种的菌丝已基本适应了固体培养基，而且也比母种的菌丝要健壮得多，因此用作栽培种的培养基可以更粗放些、更广泛些，用于原种培养基的配方，一定都能适用于栽培种的培养基制作。原种和栽培种的培养基配方有很多。可以根据食用菌的营养源，再根据所栽培食用菌的生物学特性，结合当地的原料来源，配制多种原种、栽培种的培养基。

图11　斜面试管培养基的制作

1.分装试管　2.塞棉塞　3.捆扎包好　4.高压灭菌　5.摆斜面

4.接种

接种是食用菌菌种生产和栽培过程中非常重要的一个环节。人们通常把接种物移至培养基上，在菌种生产工艺中称为接种，而在栽培工艺即生产中称为下种或播种。接种一般是在无菌操作下完成的。母种是菌种生产之母，绝不允许有一点杂菌污染，因此转管的母种必须严格按照无菌操作进行，以保证母种的纯正和品质优良。首先拔去菌种试管的棉塞，夹在右手指缝间，将试管口放于酒精灯火焰上转动灼烧2～3圈。然后拿接种针蘸酒精，在火焰上灼烧灭菌，稍冷却，挑取菌种一小块接入培养基斜面中央。最后将棉塞通过火焰后塞入管口，即完成母种的接种。接种时通常手持母种，也可采用试管架固定母种进行转管（图12）。一般一支试管一次转接10支试管。

图12　母种接种法

原种的接种也是在严格的无菌操作条件下进行的。首先用左手拿起试管，用右手拔棉塞，边在酒精灯火焰上消毒接种针边把试管口向下稍稍倾斜，用酒精火焰封锁，不让空气中的杂菌侵入。其次是把消毒后的接种针伸入菌种管内，稍稍冷却，再伸入斜面菌种挑取一小块菌种，迅速移接到原种瓶中的接种穴内，紧贴培养基，再迅速塞好棉塞或用塑料布、牛皮纸扎口（图13）。接种后的菌种瓶应移入温度、湿度、光线等适宜条件培养，待菌丝长满后即为原种。菌丝体生长初期，需每天观察新生菌丝的生长情况，检查有无杂菌污染及其他异常情况，如有污染应及时淘汰。一般在24～26℃的温度条件下，各种菌种多在3天后恢复菌丝生长。一支试管可接原种8瓶左右。

图13　原种接种法

把原种接到栽培种的培养基上进一步培养就为栽培种。栽培种的培养基可为瓶装也可袋装。一般在严格的无菌操作条件下，用大镊子、铲子或小勺，每瓶接入一大块菌种或一小勺菌种即可（图14）。栽培种用塑料袋子时，接种量一般要适当地大些。塑料袋多用16厘米宽、0.03厘米厚的筒料。一般一瓶原种可接60瓶栽培种或25袋左右的栽培种。

图14　栽培种接种

5.菌种的培养

食用菌菌种的培养与其生态环境有着密切的关系。培养优良菌种与培养基的成分、水分、酸碱度、时间因子以及基质外的生态环境，如温度、光线等是否适宜，有着十分密切的关系。

（1）营养成分它是菇类赖以生存的物质基础。食用菌必须从营养基质中吸取碳源、氮源、无机盐及维生素等营养物质。从营养学角度看，栽培种培养基只要在一定时间内满足菌丝体正常生长繁殖的需要，并使菌丝体能达到一定的生长量即可。营养过多不仅增加生产成本，而且会产生不良后果。如生产木腐菌的木屑菌种时，一般用20%的米糠，超过25%则菌丝徒长，接种后对不良环境的抵抗力较差。培养基中的养分如果不足，则菌丝纤弱、生长缓慢、抗逆性差，其效果也不好。

（2）水分和空气它们是食用菌生命活动中不可缺少的条件，同时又是一对矛盾。培养基中水分多，则氧气的含量就少，反之亦然。因此在配制培养基时，要将培养基的湿度调到适宜的范围，以同时满足食用菌生长发育时对水分和氧气的需要。另外食用菌种类不同，对水分的需要量也不相同。

（3）温度它是影响食用菌菌丝生长速度最重要的一个因子。在菌种生产过程中，培养的温度过高会造成菌种早衰，太低则会导致菌丝生长缓慢而延长生产周期。又由于菌丝在生长发育过程中进行呼吸作用而产生热量，室内的温度与瓶内或袋内的温度要相差1～4℃，因此，室温应控制在比该菌种最适温度低2～3℃。如果只有一间控温培养室而要培养各种品种的菌种时，那么就应把温度控制在22～25℃。

（4）光照各种食用菌在菌丝培养阶段均不需要光照或只需要微弱的散色光。菌种最好在避光条件下培养，培养室平时需要用黑布窗帘遮光。

（5）酸碱度大多数食用菌喜酸性的培养基，但一般的草腐菌，如草菇、双孢菇、球盖菇等喜欢在中性偏碱性的环境下生长。要注意的是培养基灭菌前后pH有一差值，所以要配制该菌种最适pH的培养基，应在灭菌前应稍高些。

（6）培养时间它对菌种生产者来讲也是应该注意的。菌种从分离出来，随着时间的推移会越来越老，培养时间越长，菌种越易衰退。瓶内的培养基随着培养时间的延长，营养成分会越来越少，菌丝也会由于生理饥饿而由强变弱，当营养消耗完后，若不及时补给，菌丝就会死亡，因此作为菌种应在菌丝生长处于最佳期进行扩大培养或栽培。