上述途径培育得到的植株,必须经过严格地鉴定,证明确实无病毒存在,才可以提供给生产应用。病毒检测,是确定草莓感染病毒种类和危害程度的重要技术手段。通过专门的病毒检测途径,确定草莓的栽培植株是否带有病毒、所带的病毒种类以及病毒的积累、危害程度等,对于选择无病毒原种苗、确定栽培草莓的病毒病危害情况,以及提出相应的防治措施,都具有重要的意义。
常见的草莓病毒病检测方法,有指示植物检测法、血清学检测法、分子生物学检测法以及电镜检测法。
指示植物,指的是对某种或某几种病毒及类似病原物敏感,并且能较快显现出特有症状的植物。检测草莓病毒病常用的指示植物有野生草莓的两种类群,一种是森林草莓(F.vesca),另一种是深红草莓(F.virginiana)。目前国际上检测草莓病毒病通用的,是森林草莓中的EMC、Apline、UC4、UC5、UC6,以及森林草莓中的UC11、UC12。其中,以EMC、Apline、UC4、UC5应用较多。
(1)检测病毒指示植物的种类及效果。
在几种常用的草莓病毒检测指示植物中,不同的指示植物有各自不同的检测病毒种类,对同种病毒显现出的症状也往往有明显的差异。
1)EMC。检测范围广泛,有较大的实用价值。由于它本身常常潜带潜隐病毒A,而易与其他病毒复合侵染,使显现的症状更加清晰。所以是草莓斑驳病毒、轻型黄边病毒及潜隐病毒C理想的检测指示植物。但它在夏季高温季节叶片易出现斑点,因而影响对斑驳病毒的症状确定。
2)Apline。对蚜虫传播病毒有很好的诊断效果,而常被用在草莓病毒的蚜虫传染实验中。对检测草莓斑驳病毒、镶脉病毒,皱缩病毒及轻型黄边病毒等,均有较敏感的症状反应。
3)UC4。对斑驳病毒、皱缩病毒和轻型黄边病毒,有较好的检测效果。但不能检测镶脉病毒和潜隐病毒。
4)UC5。对多种病毒敏感,对潜隐病毒尤为敏感,对卷叶病毒是唯一敏感的指示植物。该植物耐病毒侵染,适合保存病毒,而且长势旺,叶柄粗壮,在小叶嫁接中容易成活。
5)UC6。在检测草莓镶脉病毒中明显优于其他指示植物。而对轻型黄边病毒是无症寄主,可用作保存轻型黄边病毒。
6)UC11。对皱缩病毒特别敏感,很容易显现症状。
7)UC12。既是检测镶脉病毒最好的指示植物,也是深红草莓中对拟轻型黄边病毒唯一敏感的指示植物。
各种病毒在指示植物上虽有不同的典型症状,但在实践中,同一株草莓有多种病毒复合侵染,造成某种指示植物常有多种症状反应,使得症状的变化很大。因此,为了很好地明确病毒种类,采用了成套应用指示植物的做法,常将UC4、UC5、UC6和UC10这四种指示植物同时应用,并进行比较分析,从而保证了检测结果的准确性。在常用的指示植物中,UC5对多种草莓病毒的敏感性都比较高,而且其生长势强,叶柄粗,易嫁接成活,而作为检测草莓病毒比较理想的指示植物。
(2)草莓病毒病小叶嫁接检测方法。
1)检测材料准备。在嫁接接种前1.5~2个月,将预用指示植物单株盆栽,栽后置于温、湿度及光照控制较好的温室中,加强管理并注意防治病虫害,促使指示植物苗生长健壮、组织充实。在嫁接接种当天,从待检测病毒的草莓植株上剪取完整的成熟叶片,剪后放入装有清水的烧杯中,保持嫁接叶片湿润、新鲜。注意标明待检株标号。
2)嫁接接种。先剪去待检株叶片的左右两片小叶,用中央小叶并带有1.0~1.5厘米长的小叶柄,将叶柄下部用锋利的刀片削成楔形作为接穗,准备向指示植物苗上嫁接。选生长健壮的指示植物叶片,除去中央小叶,在保留两侧小叶的两个叶柄间向下纵切1.5~2.0厘米长的切口,而后把待检接穗迅速地接入切口中,用塑料薄膜带包扎嫁接口。每株指示植物苗可同时接数片同株待检株的叶片,以便进行检测症状的印证。为了确保嫁接叶片成活,嫁接后要把整株盆栽罩上塑料罩,以利于保温和保湿。
3)症状观察。小叶嫁接后秋季经14~20天,春、冬季经25~30天,接入的小叶不萎蔫,不枯死,即表明嫁接成活。这时可剪去未嫁接的老叶,继续加强嫁接苗的管理,定期观察新长出叶片上的症状表现。发病调查一般应连续进行1.5~2个月。
4)主要病毒的症状表现。症状出现的时间,草莓斑驳病毒的症状往往显现最早,一般在嫁接成活后7~14天即有症状表现;其次是草莓镶脉病毒和轻型黄边病毒,两者显现症状的时间分别为15~30天和24~37天;草莓皱缩病毒显现症状最晚,要在嫁接成活后39~57天才表现出来。
在我国已经调查明确的四种蚜虫传播病毒,它们的最佳指示植物及主要症状表现见表1。
表1 四种蚜虫传播草莓病毒的检测指示植物及主要症状
病毒复合侵染的症状表现为:当斑驳病毒与轻型黄边病毒复合侵染时,幼叶褪绿并卷曲成杯状,叶柄缩短,植株矮化。斑驳病毒与皱缩病毒复合侵染时,表现出明显的皱缩症状。斑驳病毒与镶脉病毒复合侵染时,两种病毒都表现症状,但斑驳症状占优势。
植物病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋白,因而是一种较好的抗原,给动物注射后会产生抗体,抗体存在于血清之中称为抗血清。不同病毒产生的抗血清有各自的特异性。用已知抗血清可以鉴定未知病毒的种类。这种抗血清就是高度专一性的试剂,这种方法特异性高,测定速度快,一般几小时甚至几分钟就可以完成。所以抗血清法成为植物病毒鉴定中最有用的方法之一。抗血清鉴定法要进行抗原的制备(包括病毒的繁殖,病叶研磨和粗汁液澄清等),抗血清的采收,分离等。血清可分装到小玻璃瓶中,贮存在-15~-25℃的冰冻条件下。测定时,把稀释的抗血清与未知的病毒植物在小试管内混合,这一反应导致形成可见的沉淀。然后根据沉淀反应来鉴定病毒。
在草莓的病毒检测中,传统的方法是采用指示植物法进行生物学检测。这对确定病毒的侵染性和检测病毒的实用性,都有重要意义。但是,这种方法总共需要较长时间,有时还需反复验证,特别是在检测环境条件不能保证时,很容易造成检测结果不准确,近年建立并应用了血清学检测方法以后,缩短了检测时间,也保证了检测的准确性,但是仍存在着有些病毒的抗血清难以制备,病毒含量低时难以检测,以及植株体内常存在着某些干扰物质影响检测准确性等缺点。特别是对那些没有外壳蛋白的病原核糖核酸,如类病毒,无法用血清学方法进行检测。近年在很多植物的病毒检测中,研究并开始应用了分子生物学检测方法,在检测病毒的灵敏度、特异性反应及检测速度等方面,都克服了血清学方法的很多不足,逐步形成了一条新的检测途径。现在有三种分子生物学方法检测草莓病毒。
(1)双链RNA法。草莓在受RNA病毒侵染的植物体内,有相应复制形式的双链RNA存在,而在健康植株中未发现病毒的dsRNA。
(2)核酸分子杂交检测法。用互补DNA检测草莓单链RNA病毒的方法,又称DNA分子杂交法。
(3)聚合酶链反应(PCR)检测法。一种体外快速扩增病毒核酸序列并加以检测的技术。
借助电子显微镜能分辨0.5微米大小的病毒颗粒。这样可以直接观察病毒,检查出有无病毒存在,了解病毒颗粒的大小、形状和结构,又可以鉴定病毒的种类。这是一种较为先进的方法,但需一定的设备和技术。
由于电子的穿透力很低,制品必须薄到10~100微米,通常制成厚20微米左右的薄片,置于铜载网上,才能在电子显微镜下观察到。
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