植物组织培养在农业上的应用及植物组织培养新技术

一、植物组织培养在农业上的应用

植物组织培养在农业生产上主要应用于植物快繁、植物脱毒、新品种培育、植物种质资源保存及生产有用的次生代谢物等。

（一）植物离体快速繁殖

植物离体快速繁殖是植物组织培养在生产上应用最广泛、经济效益较高的一项技术，主要应用于那些通过其他方式不易繁殖，或繁殖率较低的植物繁殖上。其商业性应用始于20世纪70年代美国兰花工业，80年代已被认为是能够带来全球经济利益的产业。据报道，全球有1 000多家组培公司，美国有100多家兰花组培公司，年产值5 000万～6 000万美元（1美元 ≈6.48元人民币）。例如，美国的Wyford国际公司设有4个组培室，每年培养的观赏花卉、蔬菜、果树及林木等组培苗有3 000万株，研究和培育的新品种有1 000多个；以色列的Benzur公司年产观赏植物组培苗800万株；印度的Harrisons Malayalam有限公司年产观赏植物组培苗400万株。

通过离体快繁可在较短时期内迅速扩大植物的数量，在合适的条件下每年可繁殖出几万倍，乃至百万倍的幼苗。如1个草莓芽1年可繁殖1亿个芽，1个兰花原球茎1年可繁殖400万个原球茎，1株葡萄1年可繁殖3万株。

植物组培快繁技术在我国也得到了广泛的应用，到目前为止已报道有上千种植物的快速繁殖获得成功，包括观赏植物、蔬菜、果树、大田作物及其他经济作物。我国已有 300 多家科研单位和种苗工厂进入批量生产阶段。如海南、广东、福建的香蕉苗，云南、上海的鲜切花种苗，广西的甘蔗种苗，山东的草莓种苗，江苏、河北的速生杨种苗等。

（二）脱毒苗的培育

植物脱毒往往是和植物快繁结合在一起应用的。植物在生长发育过程中几乎都要遭受到病毒不同程度的侵染，特别是靠无性繁殖的植物，感染病毒后会代代相传，越染越重，严重地影响了产量和品质，给生产带来巨大损失。如草莓、马铃薯、甘薯、葡萄、香蕉等植物感染病毒后会造成产量下降、品质变劣；兰花、菊花、百合、康乃馨等观赏植物受病毒危害后，造成产花少、花小、花色暗淡，大大影响了其观赏价值。解决这种问题的方法只有进行脱毒培养。如大蒜脱毒后叶面积增加58%～96%，蒜头增产32%～114%，蒜薹增产66%～175%；甘薯脱毒后增产17%～158%，并且大、中薯率提高；马铃薯脱毒后株高增加63%～186%，增产50%～90%；柑橘无病毒苗可提高产量15%～45%，并且着色好、糖度高；草莓无病毒苗可提高产量20%～60%。

自20世纪50年代发现采用茎尖培养方法可除去植物体内的病毒以来，脱毒培养就成为解决病毒危害的主要方法。植物的脱毒原理是在植物体内病毒分布不均匀，在茎尖0.1～1 mm的部位含量较低或者不含有病毒，切取一定大小的茎尖分生组织进行培养，再生植株就可能脱除病毒，从而获得脱毒苗。脱毒苗恢复了植物原有的优良种性，生长势明显增强，整齐一致，产量提高，品质得到改善。如大蒜脱毒后蒜头直径由4.7 cm增加到7.2 cm；马铃薯脱毒后增产50%～100%，近两年脱毒的种薯已在主产区普及，推广面积达11.3万公顷，而且在日本、荷兰、越南等国也已大面积应用；兰花、水仙、大丽花等观赏植物脱毒后植株生长势强，花朵变大，产花量上升，色泽鲜艳。

目前，利用组织培养脱除植物病毒的方法已广泛应用于花卉、果树、蔬菜等植物上，并且我国已建立了很多脱毒种苗生产基地，培养脱毒苗供应全国生产栽培，经济效益非常可观。

（三）植物新品种的培育

1.花药和花粉培养（单倍体育种）

通过花药或花粉培养可获得单倍体植株，不仅可以迅速获得纯的品系，更便于对隐性突变的分离，较常规育种大大地缩短了育种年限。1964年，印度的Guba和Maheshwari培养毛叶曼陀罗花药获得了第一株单倍体植株，从而促进了花药和花粉培养的研究，以后在烟草、水稻、小麦、玉米、番茄、甜椒、草莓、苹果等多种植物上获得成功。如1974年我国科学家用单倍体育成世界上第一个作物新品种—— 烟草“单育1号”，之后又育成水稻“中花8号”、小麦“京花1号”等新品系。

由于单倍体植株往往不能结实，在花药或花粉培养中用秋水仙素处理，可使染色体加倍获得同源二倍体的纯合系，其后代不会分离，可以直接用于选育杂种一代的亲本或性状纯合的常规品种。与常规育种方法相比，通过花药和花粉培养获得单倍体的单倍体育种方法，可以在短时间内得到作物的纯系，从而加快了育种进程。

2.胚培养

胚培养是植物组织培养中最早获得成功的技术。在植物种间杂交或远缘杂交中，杂交不孕给远缘杂交带来了许多困难，采用胚的早期离体培养可以使胚正常发育并成功地培养出杂交后代，并通过无性系繁殖获得数量多、性状一致的群体，从而育成新品种，如苹果和梨杂交种、大白菜与甘蓝杂交种、栽培棉与野生棉的杂交种等。胚培养已在50多个科、属中获得成功。利用胚乳培养可以获得三倍体植株，再经过染色体加倍获得六倍体，进而育成植株生长旺盛、果实大的多倍体植株。

3.细胞融合

通过原生质体的融合，可部分克服有性杂交不亲和性，从而获得体细胞杂种，创造新物种或优良品种。目前，已获得40多个种间、属间甚至科间的体细胞杂种植株或愈伤组织，有些还进而分化成苗。

4.选择细胞突变体

离体培养的细胞处于不断地分裂状态，容易受到培养条件和外界因素如射线、化学物质等的影响而发生变异，从中可以筛选出对人们有用的突变体，进而育成新品种。目前，用这种方法已筛选到抗病虫、抗寒、抗盐、抗除草剂毒性、高赖氨酸、高蛋白、矮秆高产的突变体，有些已用于生产。

5.植物基因工程

植物基因工程是在分子水平上有针对性地定向重组遗传物质，改良植物性状，培育优质高产作物新品种，大大地缩短了育种年限，提高了工作效率，为人类开辟了一条诱人的植物育种新途径。迄今为止，已获得转基因植物百余种。植物基因转化的受体除植物原生质体外，愈伤组织、悬浮细胞也都可以作为受体。几乎所有的基因工程的研究最终都离不开应用植物组织培养技术和方法，它是植物基因工程必不可少的技术手段。

（四）有用次生代谢物的生产

利用植物组织或细胞的大规模培养，可以生产一些天然有机化合物，如蛋白质、糖类、脂肪、药物、香料、生物碱及其他生物活性物质等。这些次生代谢产物往往具有一些特定的功能，对人类有重要的影响和作用。目前，用单细胞培养产生的蛋白质，将给饲料和食品工业提供广阔的原料生产前途；用组织培养方法生产微生物以及人工不能合成的药物或有效成分，有些已投入生产。目前，已有60多种植物在培养组织中有效物质的含量高于原植物，如粗人参皂苷在愈伤组织中含量为21.4%，在分化根中含量为27.4%，而在天然人参根中的含量仅为4.1%。

目前，利用植物组织培养生产的有用次生代谢产物主要集中在制药工业中一些价格高、产量低、需求量大的化合物上（如紫杉醇、长春碱、紫草宁等），其次是油料（如小豆蔻油、春黄菊油）、食品添加剂（如生姜、洋姜等）、色素、调味剂、饮料、树胶等。

（五）种质资源的离体保存

种质资源是农业生产的基础，由于自然灾害、人为活动已造成相当数量的植物消失或正在消失，特别是具有独特遗传性状的物种。如果采用植物组织培养的方式，将种质资源的外植体放到无菌环境中进行培养，并置于低温或超低温条件下保存则可以达到长期保存的目的，可节约大量的人力、物力和土地，还可挽救濒危物种。如一个0.28 m3的普通冰箱可存放2 000支试管苗，而容纳相同数量的苹果植株则需要近6 hm2的土地。

离体保存的种质资源无菌、材料小、可长期保存，便于地区间和国际间进行交流、转移。如草莓茎尖在4 °C黑暗条件下，培养物可以保持生活力达6年之久，期间只需每3个月加入些新鲜培养液。再如胡萝卜和烟草等植物的细胞悬浮物，在-196～-20 °C的低温下储藏数月，尚能恢复生长，再生成植株。

（六）人工种子

人工种子（artificial seed）是由美国生物学家Murashige提出来的，是指植物离体培养中产生的胚状体或不定芽，被包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中。人工种子技术是在组织培养的基础上发展起来的新兴生物技术，具有工厂化大规模制备和储藏、迅速推广、种子萌发率高等优点。目前，兰花、胡萝卜、小麦、杂交水稻等人工种子已进入开发阶段，可以实现工厂化、自动化生产。

人工种子在自然条件下能够像天然种子一样正常生长，它可为某些珍稀物种的繁殖以及转基因植物、自交不亲和植物、远缘杂种的繁殖提供有效的手段。

（七）观赏组培

观赏组培是指在透明的塑料瓶中培养长势慢、可观叶或观根的植物，有些是可以开花的植物，如“手指玫瑰”，如图1-4所示，并将培养瓶做成各种个性十足的流行款式，使培养基着上各种鲜艳的颜色，更具有观赏价值，可作为室内装饰或手机、钥匙等的装饰物。

图1-4　手指玫瑰

二、植物组织培养新技术

（一）植物开放式组培技术

植物开放式组织培养，简称开放组培，是在使用抗菌剂的条件下，使植物组织培养脱离严格无菌的操作环境，不需高压灭菌和超净工作台，利用塑料杯代替组培瓶，在自然开放的有菌环境中进行的植物组织培养。崔刚等采用中医理论，从多种植物中提取具有杀菌、抗菌作用的活性物质，成功研制出了具有广谱性杀菌能力的抗菌剂，并且通过开放组培方法成功建立了葡萄外植体的开放式培养。采用开放式组培技术，在培养基中添加抑菌剂，克服了非灭菌条件下魔芋组织培养污染的问题，有效地简化了实验步骤，降低了生产成本。开放组培技术突破了人工光源培养的限制，实现了大规模利用自然光进行植物培养的目标。

（二）无糖组培技术（光独立培养法）

植物组织培养过程中，小植株生长方式是以植物体靠培养基中的糖以人工光照进行异养和自养生长。由于传统的组培技术中使用的是含糖培养基，杂菌很容易侵入培养容器中繁殖，造成培养基的污染。为了防止杂菌侵入，通常将培养容器密闭，这样既造成植物生长缓慢，又容易出现形态和生理异常，同时增加了费用。20世纪80年代末，日本千叶大学古在丰树教授（见图1-5）发明了一种全新的植物组培技术—— 无糖组培技术，又叫光自养微繁技术。

图1-5　古在丰树教授

该技术是植物组织培养的一种新概念，是环境控制技术和生物技术的有机结合。其特点在于：将大田温室环境控制的原理引入到常规组织培养中，通过改变碳源的供给途径，用CO2气体代替培养基中的糖作为组培苗生长的碳源，采用人工环境控制的手段，提供适宜不同种类组培苗生长的光、温、水、气、营养等条件，促进植株的光合作用，从而促进植物的生长发育，使之由异养型转变为自养型，从而达到快速繁殖优质种苗的目的。由于该培养基主要采用多孔无机物质，如蛭石、珍珠岩和砂等作为培养基，因此不易引起微生物的污染。无糖培养技术的优点在于可大量生产遗传一致、生理一致、发育正常、无病毒的组培苗，并且缩短驯化时间，降低生产成本。目前，无糖组培技术已经成功应用于半夏、草莓、花椰菜的培养中，并且取得了很好的实验效果。但是，无糖培养法对环境要求较高，若无糖组培环境不能被控制并达不到一定的精度，就会严重影响组培苗的质量和经济效益。随着理论研究的不断深入及相关配套技术的不断完善，无糖组培技术必将成为今后组培生产的一种重要手段。

（三）新型光源在组培上的应用

目前，应用在植物组织培养上的新型光源主要有LED、CCFL、SILHOS。

LED（light emitting diode）即发光二极管，被誉为21世纪的新型光源，具有效率高、寿命长、不易破损等优点。LED波长正好与植物光合成和光形态建成的光谱范围相吻合，光能有效利用率可达80%～90%，并能对不同光质和发光强度实现单独控制。因此，在植物组织培养中采用LED提供照明，能够调控组培植物的生长发育和形态建成，缩短培养周期。LED在植物组培中的应用研究主要集中在日本和美国。日本的研究处于国际领先地位，不但开发了专门应用于植物组织培养的LED发光系统，而且与其他环境调控因子相结合，取得了一些重要的基础数据。中国一些科研机构也开始了这方面的研究，并自主开发了一些LED光源系统，用于植物组织培养。

CCFL（cold cathode fluorescent lamp）即冷阴极荧光灯管，是由日本的田中道男等自行设计和开发的新型光源，具有直径小、寿命长、热量低、红蓝光比例可控、耗电量低等优点。CCFL可作为植物组培苗的光源，运用此光源为文心兰试管苗提供光照条件，结果表明其地上部干、鲜重和试管苗的高度都有显著提高。随着进一步改进，CCFL照明系统将成为植物组织培养中的主要光源。

SILHOS是田中道男等自行设计和开发的另一种新型光源，这是一种间接照明系统，其侧部发出均匀一致的光线，光线进入反射空间经反射薄膜反射后均匀分布。此新型光源具有如下特点：只需要1只荧光灯就能提供均匀的照明，它通过一个独特的曲面反射镜使光线均匀分布；避免在照明过程中产生热量，冷空气从一侧输送管进入后带走灯管所产生的热量，然后从另一侧管道将热量输送出去，可调整和控制由照明设备引起的环境温度变化；SILHOS光源通过直立输送管道可以减少培养架不同培养层之间的温度差异。田中道男等利用SILHOS作为生菜组培光源，获得了高质量的组培苗。

新型光源克服了高压钠灯、金属卤化物灯和荧光灯寿命短、发热量大以及发光率不理想等缺点。它的应用将为组培苗的生长提供更加适宜的光照条件，有利于试管苗的生长，并且能延长光源的使用寿命，降低生产成本，还对试管苗栽培成活率有促进作用。随着相关技术的成熟和制造成本的降低，它将成为未来组织培养的应用光源。

【知识拓展】

三、植物组织培养的发展史

（一）探索阶段（20世纪初至30年代中期）

根据德国植物学家Schleiden和德国动物学家Schwann的细胞学说（cell theory）（细胞学说的两条最重要的基本原理：地球上的生物都是由细胞构成的；所有的生活细胞在结构上都是类似的），1902年，德国植物生理学家Haberlandt（见图1-6）提出了细胞全能性理论，认为在适当的条件下，离体的植物细胞具有不断分裂和繁殖，并发育成完整植株的潜在能力。为了证实这一观点，他在Knop培养液中离体培养野芝麻、凤眼兰的栅栏组织和虎眼万年青属植物的表皮细胞。由于选择的实验材料高度分化和培养基过于简单，他只观察到细胞的增长，并没有观察到细胞分裂。但这一理论对植物组织培养的发展起到了先导作用，激励后人继续探索和追求。

1904年，Hanning在无机盐和蔗糖溶液中对萝卜和辣根菜的胚进行培养，结果发现离体胚可以充分发育成熟，并提前萌发形成小苗。1922年，Haberlandt的学生Kotte和美国的Robins在含有无机盐、葡萄糖、多种氨基酸和琼脂的培养基上，培养豌豆、玉米和棉花的茎尖和根尖，发现离体培养的组织可进行有限生长，形成了缺绿的叶和根，但未发现培养细胞有形态发生能力。

在Haberlandt实验之后的30多年中，人们对植物组织培养的各个方面进行了大量的探索性研究，但由于对影响植物组织和细胞增殖及形态发生能力的因素尚未研究清楚，除了在胚和根的离体培养方面取得了一些结果外，其他方面的研究没有大的进展。

图1-6　德国植物生理学家Haberlandt

（二）奠基阶段（20世纪30年代末期至50年代末期）

直到1934年，美国植物生理学家White（见图1-7）利用无机盐、蔗糖和酵母提取液组成的培养基进行番茄根离体培养，建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，使根的离体培养实验获得了真正的成功，并在以后28年间反复转移到新鲜培养基中继代培养了1 600代。

1937年，White又以小麦根尖为材料，研究了光照、温度、培养基组成等各种培养条件对生长的影响，发现了B族维生素对离体根生长的作用，并用吡哆醇、硫胺素、烟酸3种B族维生素取代酵母提取液，建立了第一个由已知化合物组成的综合培养基，该培养基后来被定名为White培养基。

图1-7　美国植物生理学家White

与此同时，法国的Gautherer在研究山毛柳和黑杨等形成层的组织培养实验中，提出了B族维生素和生长素对组织培养的重要意义，并于1939年连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。Nobecourt也由胡萝卜建立了与上述类似的连续生长的组织培养物。1943年，White出版了《植物组织培养手册》专著，使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。White、Gautherer和Nobecourt 3位科学家被誉为植物组织培养学科的奠基人。

1948年，美国学者Skoog和我国学者崔澂在烟草茎切段和髓培养以及器官形成的研究中发现，腺嘌呤或腺苷可以解除培养基中IAA对芽形成的抑制作用，能诱导形成芽，从而认识到腺嘌呤和生长素的比例是控制芽形成的重要因素。

1952年，Morel和Martin通过茎尖分生组织的离体培养，从已受病毒侵染的大丽花中首次获得脱毒植株。1953年至1954年，Muir利用振荡培养和机械方法获得了万寿菊和烟草的单细胞，并实施了看护培养，使单细胞培养获得初步成功。1957年，Skoog和Miller提出植物生长调节剂控制器官形成的概念，指出通过控制培养基中生长素和细胞分裂素的比例来控制器官的分化。1958年，英国学者Steward等以胡萝卜为材料，通过体细胞胚胎发生途径培养获得了完整的植株，首次得到了人工体细胞胚，证实了Haberlandt的细胞全能性理论。

在这一发展阶段，通过对培养基成分和培养条件的广泛研究，特别是对B族维生素、生长素和细胞分裂素作用的研究，确立了植物组织培养的技术体系，并首次用实验证实了细胞全能性，为植物组织培养以后的迅速发展奠定了基础。

（三）迅速发展阶段（20世纪60年代至今）

当影响植物细胞分裂和器官形成的机理被揭示后，植物组织培养进入了迅速发展阶段，研究工作更加深入，从大量的物种诱导获得再生植株，形成了一套成熟的理论体系和技术方法，并开始大规模生产应用。

1960年，Cocking用真菌纤维素酶分离番茄原生质体获得成功，开创了植物原生质体培养和体细胞杂交的工作。1960年，Morel利用茎尖培养兰花，该方法繁殖系数极高，并能脱去植物病毒，其后开创了兰花快速繁殖工作，并形成了“兰花产业”。

1962年，Murashibe和Skoog发表了适用于烟草愈伤组织快速生长的改良培养基，也就是现在广泛使用的MS培养基。1964年，印度Guha等人成功地在毛叶曼陀罗花药培养中，由花粉诱导得到单倍体植株，从而促进了花药和花粉培养的研究。

1971年，Takebe等在烟草上首次由原生质体获得了再生植株，这不仅证实了原生质体同样具有全能性，而且在实践上为外源基因的导入提供了理想的受体材料。1972年，Carlson等利用硝酸钠进行了两个烟草物种之间原生质体融合，获得了第一个体细胞种间杂种植株。1974年，Kao等人建立了原生质体的高钙高pH的聚乙二醇（PEG）诱导细胞融合法，把植物体细胞杂交技术推向新阶段。

随着分子遗传学和植物基因工程的迅速发展，以植物组织培养为基础的植物基因转化技术得到了广泛应用，并取得了丰硕成果。自1983年Zambryski等采用根癌农杆菌介导转化烟草，获得了首例转基因植物以来，利用该技术在水稻、玉米、小麦、大麦等主要农作物上取得了突破进展。迄今为止，通过农杆菌介导将外源基因导入植物已育成了一批抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆境及优质的转基因植物，其中有的开始在生产上大面积推广使用。转基因技术的发展和应用表明组织培养技术的研究已开始深入到细胞和分子水平。

思考与练习

1.名词解释：植物组织培养、愈伤组织、外植体、细胞全能性、脱分化、再分化、原生质体。

2.植物组织培养的类型有哪些？

3.植物组织培养在农业上的应用主要有哪些？

4.图1-8说明植物组织培养需要注意什么样的问题？

图1-8　植物组织培养示例图