灭菌及环境的消毒

一、实验实训目的

通过实验，使学生了解并掌握组织培养所用实验器皿和器械的洗涤、灭菌及环境的消毒方法。

二、实验实训原理

实验仪器和器械的清洗、消毒及灭菌是组织培养成功的关键所在，是外植体免受污染的前提。由于灭菌剂的种类不同，所以选择消毒剂既要考虑良好的消毒、杀菌作用，又要易被蒸馏水冲洗掉。

无菌的环境是植物组织培养成功的前提，因为绝大多数操作程序要求在无菌条件下进行。

三、实验实训步骤

（一）器皿与用具的洗涤

1.玻璃器皿的洗涤

新购置的玻璃器皿或多或少都含有游离的碱性物质，使用前要先用1%的稀HCl浸泡一夜，再用肥皂水洗净，清水冲洗后，再用蒸馏水冲洗1次，晾干后备用。用过的玻璃器皿，用清水冲洗，蒸馏水冲洗1次，晾干后备用即可。

对于已被污染的玻璃器皿则必须在高压蒸汽灭菌后，倒去残渣，用毛刷刷去瓶壁上的培养液和病斑后，再用清水冲洗干净，蒸馏水冲淋一遍，晾干备用，切忌不可用水直接冲洗，否则会造成培养环境的污染。清洗后的玻璃器皿，瓶壁应透明发亮，内外壁水膜均一，不挂水珠。

2.金属用具的洗涤

新购置的金属用具表面上有一层油腻，需擦净油腻后再用热肥皂水洗净，清水冲洗后，擦干备用。用过的金属用具，用清水洗净，擦干备用即可。

3.每人清洗部分玻璃器皿

清水洗净→浸入洗衣粉溶液中洗刷→清水反复冲洗→蒸馏水淋一遍→烘干备用。

对于较脏玻璃器皿的洗涤：采用先碱后酸的方法，即用洗衣粉洗刷后冲洗干净→晾干→浸入酪酸洗液（一种强氧化剂，去污能力强，配制方法：重铬酸钾40 g，溶解在500 mL水中，然后徐徐加入450 mL粗制浓硫酸），浸泡时间视器皿的肮脏程度而定→清水反复冲洗干净→蒸馏水淋洗一遍→烘干备用。

对于带有石蜡或胶布的器皿：先将其除去，再用常规洗涤，石蜡用水煮沸数次即可去掉，胶布黏着物则需用洗衣粉液煮沸数小时，再用水冲洗，晾干后浸入洗液，以后的步骤同前。

（二）玻璃器皿、用具及环境的灭菌

1.玻璃器皿和用具的灭菌

（1）干热灭菌法。

将洗干净晾干后的培养皿、三角瓶、吸管等玻璃用具和解剖针、解剖刀、镊子等金属器具用纸包好，放进电热烘干箱，当温度升至100 °C时，启动箱内鼓风机，使电热箱内的温度均匀。当温度升至150 °C时，定时控制40 min（或120 °C定时120 min），达到灭菌的目的。但干热灭菌温度不能超过180 °C，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。

（2）高压蒸汽灭菌法。

用手提式高压灭菌锅，在1.2个大气压下保持15～20 min。有些如聚丙烯、聚甲基戊烯等类型的塑料用具也可进行高温消毒。

（3）灼烧灭菌。

用于无菌操作的镊子、解剖刀等用具除高压蒸汽灭菌外，在接种过程中还常常采用灼烧灭菌，将镊子、解剖刀等从浸入95% 的酒精中取出，置于酒精灯火焰上灼烧，借助酒精瞬间燃烧产生的高热来达到杀菌的目的。操作过程中要反复浸泡、灼烧、放凉、使用，操作完毕后，用具应擦拭干净后再放置。

（4）过滤灭菌。

某些生长调节物质在高温下易分解，可采用过滤灭菌法，把经过高压灭菌后的过滤器、滤膜、承接过滤灭菌后滤液的容器、移液管或移液枪枪头放入超净工作台，同时，将配制好的需要过滤灭菌的生长调节物质、抗生素等一并放入超净工作台；双手消毒，在超净工作台内安装过滤灭菌器；将待过滤的生长调节物质等加入过滤漏斗或注射器内，启动减压过滤灭菌器（见图2-31）或用力推压注射器活塞杆，使液体流过滤膜；将滤液按照培养基培养要求加入的量用移液管或移液枪（枪头已灭菌）立即加入已凝固的固体培养基中，如果是液体培养基则可等液体培养基冷却后再加入。

图2-31　过滤灭菌器

2.环境的消毒

（1）地面、墙壁和工作台的灭菌。

每次使用前，将配好的20%新洁尔灭溶液倒入喷雾器中，对接种室地面、墙壁、角落均匀地喷雾，在喷房顶时，注意不要让药液滴入眼睛。然后开启紫外灯开关，照射15～30 min，一般紫外线消毒后不要立即进入，应在关闭紫外灯15～20 min后再进入室内。

（2）无菌室和培养室的灭菌。

对于无菌室和培养室等无菌要求比较严格的地方，一般采用熏蒸的方法进行消毒（也可采用臭氧消毒）。一般要求每年熏蒸1～2次。首先将房子密封，然后在房子中间放一个盆或大烧杯，将称好的高锰酸钾放入其中，每立方米空间用甲醛10 mL加高锰酸钾5 g的配比液进行熏蒸，再把已称量的甲醛溶液慢慢倒入缸内，完毕，人迅速离开，并关上门，密封3 d。操作前要戴好口罩及手套，倒入甲醛时要小心，因为甲醛遇到高锰酸钾会迅速沸腾，并产生大量烟雾，操作时人要迅速避开烟雾。3 d后，打开房间，搬走废液缸，7 d后方可进入操作。在已经熏蒸过的房间内，用70%的酒精纱布擦洗培养架、工作台。

（3）臭氧消毒。

臭氧以氧原子的氧化作用破坏微生物膜的结构，以实现杀菌作用。与其他杀菌剂不同的是，臭氧能穿入菌体内部，作用于蛋白和脂多糖，改变细胞的通透性，从而导致细菌死亡。臭氧直接与细菌、病毒作用，破坏了它们的细胞器和DNA、RNA，使细菌的新陈代谢受到破坏，导致细菌死亡；另外，臭氧透过细胞膜组织，侵入细胞内，作用于外膜的脂蛋白和内部的脂多糖，使细菌发生通透性畸变而溶解死亡。臭氧杀菌，不残留有毒物质，对于公共场所、医院及厂矿企业净化室的消毒、杀菌及各种臭味的消除，可采用臭氧杀菌消毒去味。臭氧为高效、广谱、快速、无死角的杀菌剂，可移动，使用方便。臭氧灭菌一般用臭氧发生器（见图2-32），可2～3 d打开臭氧发生器消毒30 min。

图2-32　臭氧发生器

四、作　业

将本次实验实训内容整理成实验实训报告。

思考与练习

1.一个正规的植物组织培养实验室应具备哪些房间？

2.植物组织培养常用的设备有哪些？各有何用途？

3.为什么要对器皿和用具进行严格的洗涤和灭菌？