植物组织培养用的是固体培养基吗

任务三　培养基的配制

一、培养基的成分

培养基是植物组织培养的重要基质，它是植物组织培养的物质基础，也是决定组织培养成功与否的关键因素之一。植物组织培养所需要的营养成分主要从培养基中获得，大部分培养基的成分主要包括水、无机盐、有机物、植物生长调节物质、凝固剂及其他添加物质。

（一）水

水是植物原生质体的组成部分，是生命活动中不可缺少的物质，培养基中的成分绝大部分是水。在配制母液时，为保持母液中营养物质的准确性，防止贮存过程中变质，一般采用蒸馏水或去离子水。在配制培养基时，用于研究筛选培养基配方时用蒸馏水或去离子水，大规模生产时，配制培养基可用自来水代替蒸馏水，以降低生产成本。

（二）无机盐

无机盐是指植物在生长发育时所需的各种矿质营养。它能够为培养物提供除C、H、O以外的一切必需元素。植物所需元素的浓度大于0.5 mmol/L称为大量元素，植物所需元素的浓度小于0.5 mmol/L称为微量元素。

1.大量元素

大量元素主要有氮（N）、磷（P）、钾（K）、钙（Ca）、镁（Mg）、硫（S）等。

（1）氮。

氮是蛋白质的主要成分，参与各种生理代谢。在制备培养基时以硝态氮和铵态氮两种形式供应。氮素主要供给植物生长的营养，缺氮植物下部叶片变黄，愈伤组织不能形成导管。提供氮的物质有KNO3、NH4NO3、(NH4)2SO4等。

（2）磷。

磷是磷脂的主要成分，而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分。在植物组织培养过程中，向培养基内添加磷，不仅增加养分、提供能量，还能促进对氮的吸收，促进蛋白质、糖的合成，促进脂肪代谢，提高植株的抗逆性。常用的物质有KH2PO4或NaH2PO4等。缺磷或钾时细胞会过度生长，愈伤组织表现出极其疏松的状态。

（3）钾。

钾是植物体内多种酶的活化剂，能够促进糖类、蛋白质的合成，同时可促进光合作用，并且对胚的分化有促进作用。制备培养基时，常用的物质有KCl、KNO3等。

（4）钙。

钙是构成细胞壁的组成成分，能够增强植物的抗病能力，是植物体内酶的组成成分和活化剂。同时，钙对细胞分裂、保护质膜不受破坏均有显著作用，常用的物质有CaCl2·2H2O。

（5）镁。

镁是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，能够促进蛋白质的合成。常用的物质有MgSO4·7H2O。

（6）硫。

硫是蛋白质、酶、硫胺素等的组成成分。常用的物质有MgSO4·7H2O、（NH4）SO4等。

2.微量元素

微量元素包括铁（Fe）、锰（Mn）、硼（B）、锌（Zn）、铜（Cu）、钼（Mo）、钴（Co）等。它们的用量虽然少，但对植物细胞的生命活动却有着重要的作用，是植物组织培养中不可缺少的元素。

（1）铁。

铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分，是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿均有促进作用。但铁不容易被植物直接吸收，且容易产生沉淀。因此，在制作培养基时不用Fe2(SO4)3和FeCl3（因其pH在5.2以上，易形成Fe(OH)3不溶性沉淀），而用FeSO4·7H2O和Na2-EDTA（乙二胺四乙酸钠）结合成螯合态铁使用。

（2）锰。

锰是维持叶绿素结构的必需元素，参与植物的氧化还原反应，同时是三羧酸循环中多种酶的催化剂，并影响根系的生长。常用的物质为MnSO4·4H2O。

（3）硼。

硼能够促进植物生殖器官的发育，并且与糖的运输、蛋白质的合成有关；缺硼叶片向上卷曲、失绿、细胞停止分裂。常用的物质为H3BO3。

（4）锌。

锌是植物体内各种酶的组成成分，可促进植物体内生长素的合成。常用的物质为ZnSO4·7H2O。

（5）铜。

铜参与蛋白质的合成和固氮作用，同时能促进离体根的生长。常用的物质为CuSO4·5H2O。

（6）钼。

钼参与氮代谢和繁殖器官的形态建成，可促进光合作用。常用的物质为钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）。

（7）钴。

钴是维生素B12的组成成分，在豆科植物固氮中起重要作用。常用的物质为CoCl2·6H2O。

（三）有机物

1.糖

糖是碳水化合物，为培养物生长发育提供碳源和能源，并维持培养基的渗透压。常用的糖有蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖，其中最常用的是蔗糖。蔗糖使用浓度一般在2%～5%，常用3%，即配制1 L培养基需称取30 g蔗糖。生根培养时可降低蔗糖浓度，有利于提高试管苗的自养能力。由于蔗糖的价格较贵，在大规模生产时，可用食用的白砂糖来代替蔗糖。

2.维生素

维生素在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。正常的植物能够自己产生维生素来维持生命活动，立体培养的外植体在培养过程中能合成所必需的维生素，但合成数量上还明显不足，因此必须人为添加才能维持正常生长。常用的维生素如下：

（1）VBl（盐酸硫胺素）：能够促进愈伤组织的产生，全面促进植物生长，是最重要的B族维生素。

（2）VB6（盐酸吡哆醇）：可促进根系生长。

（3）VB3（烟酸，又称维生素PP）：与植物代谢和胚发育有一定的关系。

（4）VC（抗坏血酸）：具有抗氧化的作用，作为抗氧化剂，在组织培养中可有效防止褐变的发生。

（5）VB7（生物素，又称维生素H）：是植物体内许多酶的辅助因子，在碳水化合物、脂类、蛋白质和核酸的代谢过程中发挥重要作用。

（6）VB11（叶酸）：对蛋白质、核酸的合成及氨基酸代谢有重要作用。

3.肌　醇

肌醇又称环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长、胚状体和芽的形成，对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用，但肌醇用量过多易导致外植体褐变，一般使用浓度为100 mg/L。

4.氨基酸

氨基酸在组织培养中是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用，促进蛋白质的合成，对芽、根、胚状体的生长和分化均有良好的促进作用。组织培养中常用的氨基酸有甘氨酸（Gly）、精氨酸（Arg）、谷氨酸（Glu）、谷氨酰胺（Gln）、天冬氨酸（Asp）、天冬酰胺（Asn）、丙氨酸（Ala）、丝氨酸（Ser）、半胱氨酸（Cys）及氨基酸的混合物，如水解乳蛋白（LH）和水解酪蛋白（CH）等。其中，甘氨酸能促进离体根的生长，对植物组织的生长具有良好的促进作用；丝氨酸和谷氨酰胺有利于花药胚状体或不定芽的分化；半胱氨酸具有延缓酚类物质氧化和防褐变的作用；水解乳蛋白和水解酪蛋白对胚状体、不定芽的分化有良好的作用。

5.天然有机添加物

天然有机添加物含有一定的植物激素和各种维生素等复杂的成分，能促进细胞和组织的增殖与分化，促进愈伤组织和器官的生长。组织培养中常加入的天然有机添加物有椰乳（CM）、酵母提取液（YE）、马铃薯、香蕉汁、苹果汁、番茄汁等天然有机物。

（1）椰乳。

椰乳是椰子的液体胚乳，是使用最多、效果最大的一种天然复合物。它在愈伤组织和细胞培养中起明显的促进作用，一般使用浓度为10%～20%。

（2）香蕉汁。

香蕉汁是用黄熟的小香蕉，加入培养基后变为紫色，对pH的缓冲作用大，主要在兰花的组织培养中应用，对其发育有促进作用，一般用量为150～200 mL/L。

（3）马铃薯。

马铃薯去掉皮和芽后，加水煮30 min，再经过滤，取其滤液使用。马铃薯对pH缓冲作用也较大，添加后可使植株健壮，用量为150～200 g/L。

（4）其他。

酵母提取液使用浓度为 0.01%～0.05%，主要成分为氨基酸和维生素类；麦芽提取液使用浓度为0.01%～0.5%，主要成分为苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。

（四）生长调节物质

生长调节物质是培养基中的关键性物质，它影响着植物细胞的分化、分裂、发育、形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动，用量虽然微小，但对植物组织培养起决定性作用。植物组织培养中常用的有生长素类和细胞分裂素类物质。

1.生长素类

在组织培养中，生长素的主要作用是促进细胞伸长生长和分裂；诱导愈伤组织形成；促进生根，在与一定量的细胞分裂素配合使用下可诱导不定芽分化和侧芽的萌发与生长。植物组织培养过程中常用的生长素类物质主要包括吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）。

NAA和IBA广泛用于生根，NAA是人工合成的，性质比较稳定，与IBA相比，NAA诱导生根的能力比较弱，诱导的根少而粗，但在某些植物上诱导的效果好于IBA；IAA是天然存在的生长素，也可人工合成，其活力较低，对器官形成的副作用小；IBA是天然合成的生长素，可被光分解和酶氧化，对根的诱导作用强烈，诱导的根多而长；2，4-D是一种人工合成的生长素，在促进愈伤组织形成上启动能力比IAA高10倍，但对芽的形成和根的分化等方面效果不好。

2.细胞分裂素类

细胞分裂素主要的生理功能包括促进细胞分裂和扩大、诱导芽的分化、促进侧芽萌发、抑制衰老和根的发育。细胞分裂素常与生长素配合使用，通常情况下，当生长素与细胞分裂素的比值大时，可促进根的形成；当生长素与细胞分裂素的比值小时，可促进芽的形成，组织培养中常用的细胞分裂素类物质有6-苄基氨基嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、玉米素（ZT）等。6-BA和KT均是人工合成的，6-BA的作用效果远远好于KT，是应用最广泛的细胞分裂素；ZT对芽的诱导效果很好，但性质不稳定，在高温下易分解。

3.其他生长调节物质

赤霉素（GA）的主要作用是促进幼苗茎的伸长生长；对植物器官和胚状体的形成有抑制作用，但在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长，促进不定胚发育成小植株；同时，赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响，当生长素与赤霉素的比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化。

脱落酸（ABA）对体细胞胚的发生发育具有促进作用，同时可使体细胞胚发育成熟而不萌发，对部分不定芽的分化具有促进作用。

多效唑（PP333）具有控制矮化、促进分枝、生根、成花、延缓衰老、增强植物抗逆性的作用，在植物组织培养中主要用于试管苗的壮苗生根，提高抗逆性和移栽成活率。

（五）凝固剂

1.琼　脂

琼脂（Agar）是从石菜花等海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养，无毒、无气味，是制备固体培养基时一种很好的凝固剂，市场上出售的琼脂有琼脂条和琼脂粉，琼脂条价格相对便宜，用量较多，煮化的时间较长；琼脂粉纯度较高，凝固力强，煮化时间短，但价格较贵。

琼脂不溶于冷水，缓溶于热水，琼脂在90 °C左右融化，40 °C左右凝固。其用量一般为6～10 g/L，若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去，培养材料不能很好地吸收培养基中的养分；若浓度过低，凝固性不好，培养材料在培养基中下沉，造成通气不良而死亡。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH等因素有关，长时间的高温会使其凝固力下降，过酸过碱加上高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力，过酸会使培养基不易凝固，过碱易使培养基变硬。

2.卡拉胶

卡拉胶（Carrageenan）是从麒麟菜、石花菜、鹿角菜等红藻类海草中提炼出来的亲水性胶体。卡拉胶为白色或浅褐色颗粒或粉末，无臭或微臭，口感黏滑，溶于约80 °C的水，形成黏性、透明或轻微乳白色的易流动溶液，与30倍的水煮沸10 min后的溶液，冷却后即成胶体。在中性条件下，若卡拉胶在高温下长时间加热，也会水解，导致凝胶强度降低。与琼脂相比，卡拉胶做培养基透明度更高。

（六）其他添加物

1.活性炭

活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉末结构。在培养基中加入活性炭的目的是利用活性炭的吸附性减少一些有害物质的不利影响，有利于生根，对器官发育并无太大作用。同时，在培养基中加入活性炭，还可降低玻璃化苗的产生频率，对防止产生玻璃化苗有良好作用。但是活性炭的吸附作用没有选择性，既吸附有害物质，也吸附必需的营养物质。有研究显示，1 mg的活性炭能吸附100 mg左右的生长调节物质，这说明只需要极少量的活性炭就可以完全吸附培养基中的生长调节物质。另外，培养基中加入活性炭后经过高压灭菌，培养基的pH会降低，使琼脂不易凝固，因此要多加一些琼脂。

2.抗氧化物质

在植物组织培养过程中，植物组织会分泌一些酚类物质，接触空气中的氧气后自动氧化或由酶类催化氧化为相应的醌类，这些物质渗出细胞外就造成自身中毒，使培养的材料生长停止，失去分化能力，最终褐变死亡，在木本，尤其是热带木本及少数草本植物中较为严重。

针对容易发生褐变的培养物，在培养过程中添加抗酚类氧化物质可以减轻褐变，常用的药剂有半胱氨酸、抗坏血酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、二硫苏糖醇、谷胱甘肽及二乙基二硫氨基甲酸酯等，一般用量为5～20 mg/L。具体使用方法：可以用溶液洗涤刚切割的外植体伤口表面，或过滤灭菌后加入固体培养基的表层。

（七）培养基的pH

培养基的pH因培养材料的不同而异，大多数植物要求pH为5.6～5.8，培养基的pH经高温高压灭菌后会下降（蔗糖的分解会使培养基变酸，一般可降低0.2左右），因此调整后的pH应高于目标pH。同时pH的大小会影响琼脂的凝固能力，一般pH＞6.0时培养基会变硬，pH＜5.0时琼脂不能很好凝固，培养基酸碱性的调节常用0.1 mol/L的HCl和0.1 mol/L的NaOH来调节，调节过程中要逐渐添加，避免一次大量加入。

二、培养基的种类及特点

（一）培养基的种类

培养基的分类方法有很多种，根据不同的植物和培养部位及不同的培养目的需选用不同的培养基。

（1）根据营养水平不同分为基本培养基和完全培养基。

基本培养基是指只含无机盐、有机物、维生素、肌醇、氨基酸等营养成分的培养基，就是通常所说的MS、White、B5、N6等培养基。

完全培养基是由基本培养基中添加适宜的植物生长调节物质、有机附加物、凝固剂等组成的可直接用于组织培养的培养基。

（2）根据培养基的物理状态分为固体培养基和液体培养基。

固体培养基是指添加了琼脂或卡拉胶的固体型培养基；液体培养基则是指未添加凝固剂的液态型培养基。

（3）根据培养的阶段分为初代培养基和继代培养基。

初代培养基是指用于外植体的第一次接种培养的培养基；继代培养基则指用于培养初代培养物以后的培养基。

（4）根据培养的目的分为诱导培养基、增殖培养基、壮苗培养基和生根培养基。

诱导培养基是指用于诱导愈伤组织形成和器官分化尤其是芽形态发生的培养基；增殖培养基是指用于愈伤组织或芽的增殖的培养基，附加成分与分化培养基在量上有一定差异，但在质上差异不大；壮苗培养基是指用于壮苗培养（在继代培养过程中，增殖的芽往往会出现生长势减弱，不定芽短小、细弱，无法进行生根培养的现象，即使能够生根，移栽成活率也不高，必须经过壮苗培养）的培养基；生根培养基是指用于诱导外植体生根的培养基，通常不加激素或加少量的生长素。

（二）几种常用培养基的配方

几种常用培养基的配方如表2-1所示。

表2-1　几种常用培养基的配方　　mg/L

续表

（三）常用基本培养基的特点

1.MS培养基

MS培养基是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。其特点是无机盐浓度较高，钾盐、铵盐、硝酸盐含量较其他培养基高，营养丰富，其养分的数量和比例较合适，不需要添加更多的附加物，可满足植物组织生长的需要，具有加速培养物生长的作用，是目前应用最广泛的一种培养基。

2.White培养基

White培养基是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。其特点是无机盐离子浓度较低，适于生根培养。

3.B5培养基

B5培养基是1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是钾盐和盐酸硫胺素含量高，铵盐含量较低，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。双子叶植物特别是木本植物在B5培养基上生长更好。

4.N6培养基

N6培养基是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单，KNO3和(NH4)2SO4含量高，在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。

【知识拓展】

朱至清（1939—），男，中国科学院植物研究所研究员，为中国科学院植物研究所学术委员会委员、中国科学院生物技术委员会委员、植物学报编委。其主要研究领域是植物细胞培养与生物技术，在禾谷类花药培养、体细胞无性系变异和基因工程上发表论文50余篇，是我国植物生物技术学术带头人。1978年主持植物单倍体育种、1982年主持花药培养及其应用、1992年主持禾谷类高效培养基、1993年主持禾谷类高效细胞培养基等重大课题。

5.Nitsh培养基

Nitsh培养基是1951年由Nitsh设计的。其特点是大量元素含量低，微量元素种类少，氮含量高，主要用于花药培养。

6.Miller培养基

Miller培养基是1963年由Miller设计的。其特点是无机元素比MS培养基量减少1/3～1/2，微量元素种类减少，无肌醇，主要用于花药培养。

7.KM-8P培养基

KM-8P培养基是1975年由Kao等为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。

8.VW培养基

VW培养基是1949年由Vacin和Went为气生兰组织培养而设计的。其特点是总的离子强度稍低，磷以磷酸钙形式供给，要先用1 mol/L HCl溶解后再加入混合溶液中。