外植体的选取及处理

一、外植体的选取原则

（一）选择优良的种质

无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培养材料的选择要从主要的植物入手，选取性状优良的种质或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的、具有一定的代表性，以提高成功的概率，增加其实用价值。

（二）选择健壮的植株

组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株上，选取发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代谢旺盛，再生能力强，培养后比较容易成功。

（三）选择最适的时期

组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和植物的生长发育阶段。如快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，这样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高；花药培养应在花粉发育到单核期时取材，这时比较容易形成愈伤组织。

（四）选择适宜的大小

建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异。材料太大，容易污染，也没必要；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难于成活。一般选取培养材料的大小为0.5～1.0 cm。如果是胚胎培养或脱毒材料的培养，则应更小。

二、外植体的处理

外植体的消毒处理是组培成功与否的第一关键步骤。外植体的处理主要包括以下两个方面。

（一）外植体的预处理

对外植体进行修整，去掉不要的部分，在流水下冲洗干净。

（二）外植体的表面灭菌

其原则是充分灭菌，但不伤外植体；不同的外植体，灭菌的要求也不一样。

1.花药的灭菌

用于组织培养的花药，按小孢子发育时期要求，实际上大多没有成熟，花药外面有萼片、花瓣或颖片、稃片包裹着，通常处于无菌状态。所以一般用70% 的酒精对整个花蕾或幼穗浸泡数秒，用无菌水清洗2～3次，然后将整个花蕾浸泡在饱和漂白粉清液中10 min，或用2.0%的次氯酸钠消毒10 min，或用0.1%的氯化汞处理5～10 min，处理后用无菌水清洗3～5次，然后剥取组织接种。

2.果实及种子的灭菌

果实及种子的灭菌根据果皮或种皮的软硬结实程度及干净程度而异。对于果实，一般用2%的次氯酸钠溶液浸泡10 min，用无菌水冲洗2～3次，然后解剖内部的种子或组织接种；种皮较厚且坚硬的种子，通常用10%的次氯酸钙或0.1%～0.2%的氯化汞浸泡20～30 min或数小时，或者常规消毒后无菌水浸泡30 min至数小时。另外也可以用砂布打磨、温水或开水浸煮5 min左右以软化种皮；进行胚或胚乳培养时，可去掉坚硬的种皮后进行常规消毒。

3.茎尖、茎段、叶柄及叶片的灭菌

灭菌方法与花药的灭菌方法相同。对于茎叶，因为暴露在空中，且生有毛或刺等附属物，所以灭菌前洗涤至关重要，尤其是多年生木本材料，要用洗衣粉、肥皂水等进行洗涤，然后用自来水长时间流水冲洗0.5～2 h，之后用吸水纸将水吸干，再用70%的酒精漂洗。然后根据材料的老、嫩和枝条的坚硬程度，用1.0%～10%的次氯酸钠溶液浸泡6～15 min，或用0.1%的氯化汞消毒5～15 min，用无菌水冲洗3～5次，用无菌纸吸干后进行接种。

4.根和贮藏器官的灭菌

这类材料大多埋于土中，材料上常有损伤及带有泥土，灭菌比较困难。灭菌前，要用自来水冲洗，并用毛刷或毛笔将表面凹凸不平处及芽鳞或苞片处刷洗干净，再用刀切去损伤或难以清洗干净的部位，用吸水纸吸干后用70%的酒精漂洗一下，再用0.1%～0.2%的氯化汞浸泡5～10 min，或用2%～8%的次氯酸钠溶液浸泡5～15 min，接着用无菌水清洗3～5 次，用无菌滤纸吸干水分，进一步切削与消毒液直接接触的外部组织，然后接种。在消毒过程中，进行抽气减压，有助于消毒剂渗入，可使外植体彻底消毒。