保存与繁殖

任务三　脱毒苗的鉴定、保存与繁殖

一、脱毒苗的鉴定

（一）直接检查法

直接观察待测植株生长状态是否异常，茎叶上有无特定病毒引起的可见症状，从而可判断病毒是否存在。

（二）指示植物法

指示植物法是指将一些对病毒反应敏感、症状特征显著的植物作为指示植物（鉴别寄主），用以检验待测植物体内特定病毒存在的方法。

该方法的特点：条件简单，操作方便，经济而有效，只能测出病毒的相对感染力，不能测出病毒总的核蛋白浓度，是传统的植物病毒检测方法，如表6-4和6-5所示。

表6-4　一些常见病毒病引起的可见病症

表6-5　几种马铃薯病毒的指示植物及表现症状

1.草本指示植物鉴定

（1）汁液涂抹法：取被鉴定植物幼叶1～3 g，加10 mL水及少量0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）磨成匀浆。在指示植物叶上涂一薄层500～600目的金刚砂，用脱脂棉球蘸匀浆在叶片上轻轻摩擦，以汁液进入叶片表皮细胞又不损伤叶片为度。5 min后，以清水冲洗叶面多余匀浆和金刚砂。接种后的指示植物置防虫网室内适宜温度下，数天至几周后观察指示植物，若汁液带病毒即可出现症状。

（2）小叶嫁接法：取被鉴定植物小叶嫁接到指示植物（砧木）叶上，根据被嫁接指示植物叶上有无病毒症状，鉴定待测植物病毒，常用劈接法。若待测植物有病毒，嫁接后15～25 d就会产生症状。

2.木本指示植物鉴定（嫁接法）

（1）直接嫁接法：直接在指示植物上嫁接待检植株的芽片。该方法费时，需要几年的时间。

（2）双重芽嫁接法：先将指示植物的芽嫁接到实生砧木的基部距地面10～12 cm处，再在接芽下方嫁接待检植物的芽，两芽相距2～3 cm。成活后剪去指示植物芽上部砧木。夏秋季节进行芽接，次年即可观察到结果。

（3）双芽嫁接法：在休眠期剪取指示植物和待检植物的接穗，萌芽前分别把带有两个芽的指示植物接穗与待检植物接穗同时切接在实生砧木上，指示植物接穗接在待检植物接穗上方。各种植物病毒种类各异，指示植物繁多，表6-6仅列举了部分常用指示植物。

表6-6　部分病毒的木本指示植物及相应症状

续表

3.抗血清鉴定法

（1）原理：通过植物病毒的抗原与抗体的专化结合，形成可见反应而加以判断。由于植物病毒抗血清具有高度的专化性，受体植物无论显、隐症，无论是何种传播介质，均可通过抗血清反应法准确判断病毒是否存在，进行病毒的快速诊断。该方法特异性高，测定速度快，几小时甚至几分钟就可以完成，是植物病毒鉴定中最有用的方法之一。

（2）方法。① 叶绿体凝集法：采用待检测植物叶片提取液与专一抗血清发生凝结反应检测植物病毒，如烟草花叶病毒、马铃薯Y病毒等长形病毒。② 块茎沉淀法（试管沉淀法）：各种稀释的抗血清与病毒抗原在小试管中混合反应而产生沉淀，是常用的病毒检测方法之一。长形病毒形成絮状沉淀，球形病毒形成浓密粒状沉淀。③ 环形接口法：在毛细管或细长玻管中，抗原抗体通过扩散结合。病毒抗原位于上部呈层状，少量抗血清向毛细管渗入，至达到足够的抗原/抗体比率时，在该区域产生可见沉淀物。该方法简单、快速。④ 酶联免疫法（ELISA）：也叫酶联免疫吸附分析法，该方法灵敏度高、特异性强，能同时进行多个样品的快速测定，是近年来抗血清鉴定方法中发展最迅速、应用最广的技术。其原理是用化学处理方法将酶与抗体或抗原结合，制成酶标抗体或抗原，这些酶标记物保持其免疫活性，能与相应抗体或抗原特异结合形成酶标记免疫复合物，遇相应底物时，免疫复合物上的酶催化无色的底物，降解生成有色产物或沉淀物，前者可用比色法定量测定，后者可肉眼观察或通过光学显微镜识别。

4.分子生物学鉴定

（1）双链RNA法（dsRNA）：通过提取纯化待测植物RNA，并对其进行电泳分析，可确定dsRNA存在，从而判断待检植物是否带病毒。

（2）互补DNA（cDNA）检测法：也叫DNA分子杂交法，指用互补DNA（cDNA）检测病毒的方法。根据碱基互补原理，人工合成能与病毒碱基互补的DNA（cDNA）即cDNA探针，用cDNA探针与从待检植物中提取的RNA进行DNA-RNA分子杂交，检测有无病毒RNA存在，从而确定植物体内有无该病毒。合成cDNA时，采用同位素标记。因而检测结果可通过放射自显影显示在图像上，直观、准确。

5.电镜检测法

运用电子显微镜可直接检测待检植物体内有无病毒粒体存在，并根据所观察病毒的形态等对病毒种类进行鉴定。完全成熟的病毒叫病毒粒体，有固定形态和大小。病毒粒体的形态有杆状、线状、球状3种。杆状与线状病毒有平头和圆头的，又分别叫杆菌状和弹状病毒，不同形态的病毒大小也不相同。

电镜检测法要求制备超薄切片，具体方法如下：取待检植物鲜叶，依次用2% 的戊二醛（4～12 h）和2%的锇酸固定，乙醇系列脱水，环氧乙烷与树脂浸透，树脂包埋，最后在显微镜下切片，超薄切片厚度约20 nm。将切片置铜载网上用透射电镜观察、拍照，应注意观察维管束有无病毒粒子。检测病毒悬浮液需采用扫描电镜、投影法、背景染色法等，这些是较为先进的方法，但需一定的设备和技术。

二、脱毒苗的保存

通过不同脱毒方法所获得的脱毒植株，经鉴定确系无特定病毒者，即无病毒原种。无病毒植株并不是有额外的抗病性，它们有可能很快又被重新感染，所以一旦培育得到无病毒苗，就应很好保存，这些原种或原种材料保管得好，可保存利用5～10年。

（一）隔离保存

避免脱毒苗再次感染病毒，脱毒苗需隔离保存，最好将无病毒母本园建立在相对隔离的山上，通常无病毒苗应种植在300目（网眼为0.4～0.5 mm大小的网纱）的隔虫网内，也可用盆钵栽。栽培用的土壤也应进行消毒，周围环境也要整洁，并应及时喷施农药防治虫害，以保证植物材料在与病毒严密隔离的条件下栽培。

（二）长期保存

将无病毒苗原种的器官或幼小植株接种到培养基上，低温下离体保存，是长期保存无病毒苗及其他优良种质的方法。

1.低温保存

茎尖或小植株接种到培养基上，置于低温（1～9 °C）、低光照下保存。低温下材料生长极缓慢，只需半年或一年更换培养基，此法也叫最小生长法。国内外研究者对不同植物材料进行低温或低光照保存，取得了良好的效果，如表6-7所示。

表6-7　几种植物低温离体保存的效果

2.冷冻保存（超低温保存）

用液氮（-196 °C）保存植物材料的方法称为冷冻保存。

（1）材料选择：材料的形态与生理状况显著地影响其冷冻后的存活力。处于旺盛分裂阶段的分生组织细胞，其细胞质浓、核大，冷冻后存活力较高。而已具有大液泡的细胞抗冻力弱，在冷冻与解冻时较易受害。幼苗和茎尖同胚状体细胞相比，更易受到冷冻伤害。因此，选择适当的材料并进行预处理是必要的。

（2）预培养：培养基中添加二甲亚砜（DMSO）、山梨糖醇、ABA或提高蔗糖浓度，将材料置于其中进行短时期预培养，可提高其抗冻力。实验证明，马铃薯茎尖在含 5% 的DMSO的培养基上预培养48 h，其冷冻后的存活率高而且稳定；不经预培养（至少48 h）的茎尖，冷冻后不能再存活。

（3）冷冻防护剂预处理：在材料冷冻期间，细胞脱水会导致细胞内溶质的浓度在原生质体冻结之前增加，从而造成毒害。为避免这种“溶液效应”产生的毒害，需采用冷冻保护剂预处理。常用冷冻保护剂有DMSO、甘油、脯氨酸、可溶性糖、聚乙二醇（PEG）等，以DMSO（5%～8%）效果最好。对玉米和某些悬浮培养细胞，则以培养基中补加脯氨酸（10%）效果最好。处理方法：一般是将冷冻保护剂在30～60 min内加入冷冻混合物，使保护剂充分渗透到材料中。冷冻保护剂可降低细胞中盐的浓度，同时能防止细胞内大冰晶的形成，并减少冷冻对细胞膜的伤害。

（4）冷冻。

① 快速冷冻法：将预处理后的材料直接放入液氮内，降温速度为1 000 °C /min以上。由于降温速度快，使细胞内的水迅速越过-140 °C这一冰晶形成临界温度（细胞内产生可致死的冰晶的温度），而形成“玻璃化”状态，避免了对细胞的伤害。快速冷冻法适于液泡化程度低的小型材料。

② 慢速冷冻法：将材料以0.1～10 °C/min的降温速度由0 °C降至-100 °C左右，再转入液氮中，迅速冷冻至-196 °C。在前一阶段慢速降温过程中，细胞内的水有足够的时间渗透到细胞外结冰，从而减少了胞内结冰。慢速冷冻法适于含水量较高，细胞中含大液泡的材料。

③ 分步冷冻法（也叫前冻法）：将材料以0.5～4 °C /min的降温速度缓慢降至-30～-50 °C，在此温度下停留约30 min，转入液氮迅速冷冻。也可将材料以5 °C /min的速度逐级冷却停留，至中间温度后再速冻。在前期慢冷过程中，细胞外首先结冰，细胞内水向冰晶聚集，减少了胞内可结冰水的含量。这一方法适于茎尖和芽的保存，草莓茎尖速冻存活率为40%～60%，而分步冷冻后存活率提高到60%～80%。

④ 干燥冷冻法：将材料置于27～29 °C烘箱中（或真空中）干燥，待含水量降至适合程度后，再浸入液氮冷冻。脱水后的材料抗冻力增加，脱水程度合适的材料（如脱水至27%～40%的豌豆幼苗）在-196 °C冷冻后可全部存活。不同植物材料适宜的脱水程度不同，可通过脱水时间加以控制。

⑤ 解冻：宜采用迅速解冻方法，即把-196 °C下贮藏的材料投入37～40 °C温水中，使其快速解冻（解冻速度为500～750 °C/min），约1.5 min后把材料转入冰槽。如果室温下缓慢解冻，细胞内可重新出现结冰，造成材料死亡。已解冻的材料洗涤后再培养，可重新恢复生长。

三、脱毒苗的繁殖

（一）脱毒苗的繁殖方法

1.嫁接繁殖

从通过鉴定的无病毒母本植株上采集穗条，嫁接到实生砧木上。嫁接时间不同，嫁接方式也不同，春季多用切接、夏秋季采用腹接。嫁接技术和嫁接后管理与普通植株的嫁接相同，但嫁接工具必须专用，并单独存放。柑橘、苹果、桃等木本植物多采用嫁接繁殖，如图6-4所示。

图6-4　嫁接繁殖

2.扦插繁殖

硬枝扦插应于冬季从无病毒母株上剪取芽体饱满的成熟休眠枝，经沙藏后，于次年春季剪切扦插，如图6-5所示。绿枝扦插在生长季节4～6月进行，从无病毒母株上剪取半木质化新梢，剪成有2～3节带全叶或半叶的插条扦插。扦插后注意遮阳保湿。

图6-5　扦插繁殖

3.压条繁殖

将无病毒母株上1～2年生枝条水平压条，土壤踩实压紧，保持湿润，压条上的芽眼萌动长出新梢后，不断培土，至新梢基部生根，如图6-6所示。

4.匍匐茎繁殖

一些植物的茎匍匐生长，匍匐茎上芽易萌动生根长成小苗，如草莓（见图6-7）、甘薯。用于繁殖的脱毒母株应稀植，留足匍匐茎伸展的地面。管理重点是防虫、摘除花序、除草、打老叶。子苗（生产用脱毒苗）出圃前假植40～50 d，有利于壮苗和提高移栽成活率。

图6-6　压条繁殖

图6-7　草莓的匍匐茎繁殖

5.微型块茎（根）繁殖

从无病毒的单茎苗上剪下带叶的叶柄，扦插到育苗箱砂土中，保持湿度，1～2月后叶柄下长出微型薯块，即可用作种薯。

（二）脱毒苗繁育生产体系

为确保脱毒苗的质量，推进农作物无病毒化栽培的顺利实施，建立科学的无病毒苗繁育生产体系是非常必要的。我国农作物无病毒苗繁育生产体系归结为以下模式：

国家级（或省级）脱毒中心→无病毒苗繁育基地→无病毒苗栽培示范基地→作物无病毒化生产。

脱毒中心负责脱毒、无病毒苗原种鉴定与保存及提供无病毒母株和穗条；无病毒苗繁育基地将无病毒母株（或穗条）在无病毒感染条件下繁殖生产为无病毒苗；无病毒苗栽培示范基地负责进行无病毒苗栽培的试验和示范，在基地带动下实现作物无病毒化生产。

在我国，作物无病毒苗的培育已在多种果树、蔬菜、花卉、粮食作物与经济作物上取得了显著成效。苹果、柑橘、草莓（脱毒苗产量增加了22%）、香蕉、葡萄、枣、马铃薯、甘薯、大蒜、兰花、菊花、水仙、康乃馨等一大批无病毒苗被应用于生产。只要加强研究与管理，进一步规范无病毒苗的生产与应用，病毒病这一制约作物生产的难题就能尽快得到解决。

思考与练习

1.植物茎尖脱毒培养的技术原理是什么？其影响因素有哪些？

2.热处理脱毒的原理是什么?

3.如何利用指示植物法进行脱毒苗的鉴定？

4.写出我国的脱毒苗繁育生产体系。

5.我国脱毒马铃薯生产现状如何？

6.脱毒苗如何进行保存和繁殖？