提高水稻主要病虫害抗性

目前，我国水稻生产面临的主要病害有稻瘟病、白叶枯病、细菌性条斑病、纹枯病以及在南方稻作区发现的南方黑条矮缩病等，每造均会造成10%~30%的减产。预防和抗击病害是水稻生产过程中至关重要的环节。主要面临的虫害有褐飞虱、白背飞虱、稻瘿蚊、稻纵卷叶螟、三化螟等。目前在水稻品种资源与野生稻种质资源中均含有一些高抗水稻主要病虫害的种质基因，也是提高新品种、新组合抗病虫性的基因源。对于弱感光及感光型杂交水稻育种来说，提高其病虫害抗性极其重要。

1. 稻瘟病抗性的提高

稻瘟病是水稻最主要的病害之一，一般年份可以造成20%的减产，我国每年用在稻瘟病防治上的费用超过1亿元。今后的弱感光及感光型杂交水稻育种必须把抗稻瘟病育种作为主要内容来攻关。新品种区域试验规定把抗稻瘟病性列为新组合入选一票否决的指标，要求育种者更加重视抗稻瘟病的问题，把其列为抗性育种的首要任务。

现阶段可以在以下几个方面取得弱感光及感光型杂交水稻高抗稻瘟病育种的突破。

①抗性基因源的突破。长期以来人们不停与稻瘟病进行艰苦的斗争。1980年，我国从广西栽培稻种质资源中筛选出广谱高抗稻瘟病的红脚占、柴岩等一批品种，为当时的水稻抗稻瘟病育种提供了优异种质，也使得当时的抗性育种取得较大的进展，为生产上少用农药、降低成本做出了新贡献。但是，由于稻瘟病的生理小种发展较快，一段时间之后产生了适应红脚占等品种抗性的生理小种优势种群，使得具有红脚占等品种抗性基因的品种失去了应有的抗性。稻瘟病是造成全球水稻生产损失严重的病害，也是全球范围防治研究较深入的水稻病害。虽然科研人员已在基因挖掘方面发现了30多个基因位点，但是由于稻瘟病菌的遗传变异很快，产生的生理小种很多，近十年来过去的抗性品种几乎失去了对现有稻瘟病菌的抗性作用。广西十年来通过区试的品种均无一级抗性品种，抗稻瘟病育种再次成为人们关注的热点。

2002~2009年，陈成斌研究团队对广西14个市61个县245个乡镇1 313个原纪录分布点进行全面深入的系统调查，结果发现原来纪录的分布状况仅剩42个县140个乡镇296个分布点。调查发现新的分布点共29个（其中药用野生稻为16个），新收集野生稻种质资源共467个居群12 810个类型，经过形态鉴定和分子标记的遗传多样性分析与遗传聚类整合，去除遗传重复，长期保存的种质资源共10 346份。从2009年开始，该研究团队进行新收集种质的稻瘟病抗性鉴定研究，经过多年反复鉴定，共发现15份1级高抗稻叶瘟病和14份1级抗穗瘟病的新材料，以及一批中抗材料和在这些材料中存在的新抗性基因。该团队正在努力加快稻瘟病新抗性基因的挖掘进程，希望推进野生稻优异种质的利用，进一步开发野生稻在育种和生产上的潜力。

从目前的研究结果看，在今后短中期内稻瘟病抗性基因的新发现将主要来自野生稻种质资源。首先是普通野生稻种质资源的抗性基因挖掘，进而是AA染色体组的各个野生稻种质资源的抗性基因挖掘，再推进到非AA染色体组的野生稻的抗性基因挖掘。应通过对野生稻21个种及稻属近缘属的野生植物种质资源的重复鉴定，发现新种质，进而找到抗稻瘟病的新基因，为稻瘟病抗性育种提供新的基因源。

②抗稻瘟病育种技术突破。发现、挖掘、利用新基因，需要有新的技术方法，抗稻瘟病育种技术也需要新的突破。利用来自栽培稻与AA染色体组野生稻种质资源的抗稻瘟病基因，可以通过现在常用的有性杂交育种技术、花药培养的单倍体育种技术进行抗稻瘟病育种研究。利用来自非AA染色体组的野生稻种质资源，以及稻属的近缘属野生植物种质资源的新抗源、新基因，必须有育种技术新突破，才能实现。目前已经成熟的技术有植物分子育种技术，包含外源DNA导入的分子育种技术和转基因育种技术（也称基因工程技术），以及配合外源DNA导入后代胚挽救技术、花药培养技术，这些新技术可以提高外源DNA导入后代成功率。

外源DNA导入的分子育种技术的技术流程如下。

选择符合育种目标要求的具有优良性状的DNA供体和受体。受体多为栽培稻品种或不育系、保持系、恢复系；供体多为野生稻、近缘野生植物或稻属外作物。

受体和供体DNA准备。采用与杂交育种亲本播种栽培相同的方法插植受体亲本，做好田间水肥管理、病虫害防治等工作。选取健康供体种苗叶片，在实验室内提取纯化供体DNA。这其中要做好两件事情，一是供体种苗的种植准备，采用常规水稻亲本播种移栽管理方法准备好种苗为DNA提取提供叶片。二是实验室内提取DNA试验用具、试剂的准备，采用植物微量DNA提取方法进行供体总DNA提取、纯化、干燥、检测，获得符合外源DNA转导标准的总DNA干粉。

外源DNA导入。主要有花粉管通道导入、孕穗期微注射导入、胚芽浸泡等方法导入外源DNA，各有利弊。花粉管通道导入法可参照《广西野生稻资源研究》（陈成斌， 2005）。孕穗期微注射导入法是在水稻亲本幼穗分化期或幼穗成形期，用微量注射器吸取外源DNA液体后，把针头斜插进至孕穗部穗苞中间，注入15~20 μL DNA液体。DNA液体浓度与花粉管通道导入法相同（3 μg/10 μL）。胚芽浸泡法是在种子萌发时用DNA液体在无菌条件下浸泡24小时，然后转入无菌水湿润生长，长至1.5~2.0 cm时播种。

DNA重组体幼胚培养。为了使更多的外源DNA导入后代植株，采用胚挽救技术，对花粉管通道导入或孕穗期微注射导入的种子幼胚进行离体无菌培养，减少种子发育不良造成转导幼胚的死亡率。培养基采用野生稻花药培养分化培养基配方。

培养苗炼苗种植。获得胚培养的DNA重组苗后，炼苗7~10天后移栽至田间种植。

鉴定选育。移栽后按常规育种技术程序进行观察、鉴定、选育直至培育出优良的品系以及优良组合。

抗性鉴定。在品系选育阶段一定要进行严格的稻瘟病抗性鉴定，选出具有高抗稻瘟病的优良品系或组合。

转基因育种技术的技术流程如下。

目的基因的获得。用于感光型杂交水稻组合改良选育的目的基因，可以来源于动物、植物、微生物甚至人类的有益基因。由于基因密码、DNA结构在生物中的相同性，转基因育种技术能够有效地打破生物系统分化形成的门、科、属、种间有性隔离，能够使人类自主地创造新物种和改良原有物种。

近十年，成功运用于作物改良、新品种选育，达到生产利用的目的基因主要有抗虫的Bt基因、保鲜基因、高铁含量基因等。目前我国在水稻品种改良和新品种选育领域的转基因研究较落后，需要做大量的新基因挖掘工作。抗稻瘟病转基因育种的抗性基因主要来源应以栽培稻和野生稻的抗性基因为主，从栽培稻高抗品种和野生稻高抗种质中挖掘新的抗性基因较为安全。也可从现有栽培的粮食作物中挖掘新的基因。挖掘到目的基因后，制成基因文库备用。

把转导载体与目的基因载体进行基因重组。在抗花叶病毒基因工程研究中是通过三菌结合的实验来实现抗性基因与载体Ti质粒的结合，用Ti质粒作为转导载体。经过目的基因与载体的结合，繁殖到一定浓度后就可以与准备好的受体细胞进行目的基因的转导。

受体准备。感光型及弱感光型杂交水稻转基因育种的受体准备主要是不育系、保持系或恢复系的材料准备。一般的操作程序是取好不育系、保持系、恢复系的材料，种子经过消毒后，接种于事先准备好的无菌培养基上，在培养室内催芽，并培养至至少长出2~2.5叶。

基因转导。当叶片长到2~2.5叶时，在无菌状态下取出，用打孔器把叶片打成直径为0.5~1.0 cm的小圆片，迅速把小圆片浸入基因重组的三菌结合的载体液中，轻轻摇动液体20~30分钟。接着，把带菌的小圆片转入事先准备好的愈伤组织培养基中培养25~30天后，长出基因重组转化体愈伤组织。在愈伤组织长到0.5~1.0 cm时，及时在转导分化培养基上培养分化绿苗。培养基可选用普通野生稻及野栽杂交后代花药培养基本培养基。当绿苗长到约20 cm时进行炼苗，约1周后，洗净并移栽到有稻田土的盆中，寄栽成功后插植于大田。

重组基因检测。在炼苗或盆栽期间，按单株取叶片，提取DNA，检测转导的目的基因，证明所获取的植株是目的基因转导体，即该植株带有目的基因。

基因重组体农艺性状的鉴定。经过目的基因检测证明是目的基因转导成功的植株后，收集种子，分别进行基因重组体株系农艺性状的综合鉴定、评比选优。

株系选择。按有性杂交育种后期程序进行转基因株系的田间栽培、性状观察记载、比较选择，培育出符合感光型杂交水稻新组合要求的新株系。

品种比较。对配组成功的转基因新组合进行产量、抗性、适应性的品种比较试验。试验方法按有性杂交育种的品种比较试验程序进行。

区域试验把配组成功的转基因新组合提供给地方、国家进行水稻新品种区域试验。

2. 白叶枯病抗性的提高

虽然白叶枯病的危害在利用Xa4等抗性基因后有所降低，但其一直是水稻生产上的重大病害之一，一般会造成10%~20%的减产。在广西普通野生稻中发现的Xa23基因，具有广谱高抗特性，已被应用在水稻育种中。国际水稻研究所在长雄蕊野生稻中发现抗性基因Xa29，法国农业研究中心曾经把其转导到柑橘上，希望能成为抗黄龙病的抗源。

弱感光及感光型杂交水稻可以采取扩大抗源遗传多样性的方法提高对白叶枯病的抗性，加大野生稻抗性基因种质的利用。首先，把现有已经知道的广谱高抗基因转移到不育系和恢复系中，从而提高新组合的抗性。其次，进一步挖掘新的抗源。由于栽培稻种质资源的抗白叶枯病鉴定评价进行得比较深入，绝大多数品种已经进行过抗性鉴定筛选，因此对栽培稻种质资源的抗白叶枯病鉴定筛选的重点应在从边远地区及非发达国家收集新的传统农家品种上下工夫，以获得新的抗源。此外，还应加大野生稻种质资源的调查收集，尤其是热带及亚热带国家和地区的野生稻种质资源的收集保存、鉴定评价。在新的种质资源中鉴定筛选出新的抗性基因，再进一步利用这些高抗基因进行品种改良和新品种的培育。

由于野生稻种质资源利用难度很大，3~5年内很难育成水稻新组合，因此，在育种技术上必须进行创新、集成联动。以有性杂交育种技术为基础，结合花药培养的单倍体育种技术、分子标记育种技术、分子育种技术、转基因技术等多种育种技术进行创新育种攻关，把水稻抗白叶枯病育种水平提升至一个新的台阶。

3. 细菌性条斑病抗性的提高

水稻细菌性条斑病是20世纪80年代后才逐步发展为危害严重的病害，一般造成水稻减产20%左右，发病初始与白叶枯病的症状相似。近年来，该病发展稳定，未能引起足够的重视，研究者也不多。在水稻品种资源中存在有高抗细菌性条斑病的抗源，在野生稻种质资源中也存在有诸多的抗源有待我们进一步挖掘。对于提高弱感光及感光型杂交水稻新组合抗细菌性条斑病的途径有以下两种。

（1）发现和挖掘新的抗性基因

目前，人们对细菌性条斑病的研究整体上还不够深入，在抗源鉴定评价方面的研究也不多。就广西而言，虽然保存有2万多份栽培稻品种资源以及1万多份野生稻种质资源，但是除了少数材料进行过鉴定评价外，绝大多数的材料几乎没有进行过鉴定评价。要提高水稻新品种对细菌性条斑病的抗性，第一步就是通过鉴定评价寻找新的抗源基因，为抗性育种提供坚实的物质基础。抗细菌性条斑病的抗源可以从稻属种质资源中获得，也可以从稻属外的作物种质资源中获得。获得高抗广谱的抗源，是解决水稻新品种细菌性条斑病抗性问题的基础。

（2）采用高效的品种改良和育种技术培育新的高抗品种

除了新抗源种质，还需要有切合实际的品种改良育种技术才能抗高新抗源的利用效率。就目前的育种技术而言，提高细菌性条斑病的抗性可以以有性杂交育种技术为基础，结合花药培养的单倍体育种技术、分子标记育种技术、分子育种技术、转基因技术等多种育种技术进行创新育种攻关，把水稻抗细菌性条斑病育种推向一个新的台阶。

4. 纹枯病抗性的提高

长期以来，人们将消除纹枯病危害的重点放在栽培技术措施上，认为只要采用适当的施肥水平、后期田间晒田、保持良好通风就能有效地减少纹枯病的危害。对纹枯病的抗性育种研究、抗源鉴定筛选研究的重视不够，给人留下了栽培稻种质资源中没有纹枯病抗源的印象。提高水稻新品种对纹枯病的抗性，比提高其他主要病害的抗性更难，主要原因是该项研究基础较薄弱，起步较晚。但其有很大的超越潜能，有可能一经鉴定筛选很快就能获得新的抗源。所以，提高水稻新品种的纹枯病抗性，第一步还是进行新抗源的鉴定筛选。可以从栽培稻及野生稻种质资源的鉴定评价开始，在此基础上进一步扩展到其他作物种质资源，甚至可以在农作物近缘野生植物种质资源中进行鉴定筛选，以求获得更多更新抗源。

获得新的抗源材料就为提高水稻新品种培育提供了实现抗性育种目标的必须条件，然而，这仅仅只是万里长征的第一步，还需要进行做很多育种研究工作，需要有正确的育种技术路线和方案，采用切合育种目标的技术方法，开展育种攻关。

5. 褐飞虱抗性改良

褐飞虱对水稻生产危害极大。褐飞虱具有随气候迁飞的习性，我国南方稻区早稻的褐飞虱主要虫源为东南亚国家。因为褐飞虱的暴发很难避免，所以进行高抗褐飞虱的品种改良和育种是抵御和减轻褐飞虱危害的最经济最省力的途径。提高褐飞虱抗性的水稻品种改良首先要筛选抗源基因，即可以在大量的种质资源中筛选广谱高抗的抗源，再进一步挖掘新的抗性基因，也可以在现有抗源中分离克隆抗性基因，再进行强启动子与抗性基因的拼接，强化抗性基因的表达功能，从而提高抗性，抵抗褐飞虱的危害。Athwal（1971，1972）、Lakshm inarayana（1977）等在Mudgo、ASD7、Rathu Heenati和Bibawee这4个品种中分别发现抗褐飞虱的抗性基因Bph1、Bph2、Bph3和Bph4，在TKM6发现一个显性抑制基因I-Bph1。TKM6本身不抗褐飞虱，与不抗虫的IR24等品种杂交，后代中出现抗褐飞虱生物型I的中抗品种IR26、IR28、IR30等。其次，要落实抗性育种目标，创新育种技术。在有性杂交育种的基础上，结合各种切实有效的新技术，加快抗褐飞虱水稻育种的进程，尽快育成高产多抗的新品种。此外，要在栽培技术上加强褐飞虱危害的防治。从精准的预测预报开始，在水稻生产过程中密切关注褐飞虱等病虫害的发生发展情况，并及时喷药防治，减轻褐飞虱的危害。在成熟后期及时收获也能有效减少褐飞虱危害造成的损失。

6. 白背飞虱抗性改良

白背飞虱是水稻生产的主要虫害之一，一般会造成10%~30%的减产。白背飞虱与褐飞虱一样，也是迁飞性害虫，我国南方稻区早稻的白背飞虱主要虫源为东南亚国家。感光型杂交水稻抗白背飞虱育种和生产防治的策略与抗褐飞虱育种的策略相同，只是采用的抗源不同。目前，在野生稻种质资源中发现既高抗白背飞虱又抗褐飞虱的双抗源，广西药用野生稻中有对褐飞虱、白背飞虱达到免疫的水平的种质资源，如YD2-1593对白背飞虱免疫。利用这些野生稻种质资源，可以同时进行这两种飞虱的抗性育种研究，培育出双抗的新品种。

7. 稻瘿蚊抗性的提高

稻瘿蚊是水稻生产上危害严重、防治困难的主要病虫害之一，一旦幼虫钻入水稻茎秆内，危害就难以避免。一般年份因稻瘿蚊危害造成的损失在10%~20%之间。抗稻瘿蚊的抗源在栽培稻和野生稻中均可以找到。感光型杂交水稻抗稻瘿蚊的抗性育种研究的技术路线与抗褐飞虱一样。