灭菌和接种

一、灭菌

要根据生产条件采用不同的灭菌方式。高压蒸汽灭菌，温度可达121℃～126℃，压力为0．15兆帕，时间为60分钟。灭菌时将锅内水分加足，瓶子紧凑摆放，但不能装得过紧，要留有一定的空隙，使蒸汽流畅不产生死角，灭菌彻底。加热后当压力上升至0．05兆帕时，开启放气阀放气，指针回至零后关上，当指针继续上升到0．15兆帕时，调节　放气阀维持该压力60分钟，停止加热。自然降压后出锅。

常压蒸汽灭菌，温度为100℃，灭菌时间8～10小时。无论采用哪一种类型的常压灭菌锅，都要求锅的密封要好，否则，难以达到100℃，灭菌不彻底。灭菌时将瓶摆放在事先备好的通透性好并耐热的容器中，如铁筐、塑料筐、竹筐等，整齐地摆放在灭菌锅内，然后用保温性、密封性好的材料将锅周围封闭严实。(图5-12)加热灭菌时，要求一直保持上大气，不能间歇。另外，常压灭菌需要时间较长，用土蒸锅的要注意锅中水位，要随时补水，防止烧干锅。补水时一定要补给热水，以防温度下降。

栽培袋灭菌时，要用铁筐或塑料筐装袋，或在灭菌锅内设有蒸架，以免相互挤压变形或划破，将筐整齐地摆放在灭菌锅内，装筐不能太满，防止灭不透。

装锅同时将稀释菌种用的营养液或水装入滴流瓶中，一起灭菌。

灭菌后的培养料(大米或小麦)应松软而不烂，即疏松透气又不太干。(图5-13)如果培养基太湿、米饭太烂，菌丝难以吃透，仅在表面生长。如果太干，菌丝生长缓慢，瓶内小气候干燥，菌丝纤细无力，难以转色出草。

图5-12　常压灭菌装锅

图5-13　灭菌后的小麦培养基

灭菌后要将料瓶放在干净的冷却室内冷却。若无专门的冷却室，可利用干净的房间冷却，事先将该房间打扫干净并熏蒸消毒，切忌放在室外或杂菌较多的地方冷却。如果生产环节　安排紧凑，可直接放在接种室内。在大规模生产中，一般是将灭菌后的菌瓶或菌袋直接放到接种帐内。(图5-14)

图5-14　用于接种的接种帐

二、接种

1．消毒

接种室(箱)或接种帐要进行两次消毒:栽培前用甲醛熏蒸24小时，用量为每立方米空间用10毫升甲醛，5克高锰酸钾;或用喷雾器喷5%的石炭酸溶液或2%的来苏儿，之后关上窗门闷30分钟，同时打开紫外灯照射消毒。

使用时需再次进行消毒，首先将已灭菌并冷却的培养基、接种工具、酒精灯、支架、酒精棉球、打火机等放入接种室(箱)或接种帐内，接种室开启紫外线灯照射消毒30分钟。接种帐和接种箱用甲醛高锰酸钾熏蒸30分钟，或用气雾消毒剂，每立方米空间用药量为2～3克，点燃后闷30分钟。

2．液体菌种处理

振荡培养的液体菌种，可直接用来接种。但对于菌球浓度较大，栽培生产用种量又多的情况，就需要对液体菌种进行稀释。

在无菌室的超净工作台上或接种箱内，点燃酒精灯，将菌种瓶的瓶颈放在火焰上方进行转动烘烤几圈，在火焰上去掉瓶塞，瓶口不能离开火焰，同时将营养液瓶的封口膜去掉，在火焰上方将液体菌种倒入营养液或无菌水内进行稀释。稀释倍数一般是5～6倍。

静态培养的悬浮液菌种处理方法也是如此，即将悬浮的菌膜打碎，使其分散在溶液中，用其中的混合物接种，不用稀释。

3．接种

接种的操作过程一般是在接种室(箱)中进行，接种后搬入培养室。但大批量生产中来回搬运非常费工，因此，就可直接在培养室内设置接种帐，在帐内进行接种。

接种时，接种人员穿戴消毒过的衣服，戴上口罩进入接种帐，同时带入事先处理好的液体菌种。进入接种帐后应将周围塑料封严，防止含有杂菌的空气进入。接种操作前将接种工具、菌种外壁、操作人员双手等，用75%酒精擦拭或浸沾消毒。

点燃酒精灯，在火焰上方将接种工具进行灼烧，要将工具的尖端烧红，其他部位烧烫，烧好后放在支架上，保持在火焰上方部位。

用液体菌种接种的方法是:在帐内开启接种机，在无菌条件下，用消毒过的吸液管或注射器吸取稀释的液体菌种4～5毫升注入罐头瓶培养基中。在大批量生产中，都是采用专用接种器，通常称之为接种枪，或用连续式接种器。接种时不用揭开封口薄膜，直接将菌液注入即可。(图5-15)为了安全起见，接种口最好用一小块胶布封上，以防杂菌侵入。每接种5～6瓶就需要重新将接种工具烘烤一次，冷却之后继续接种。

图5-15　使用连续式接种器接种

接种后瓶子(图5-16)直立放置培养1～2天，控制温度在20℃～22℃，使菌丝萌发(图5-17)，定植后再上架培养。否则，菌液或营养液及培养基会倒向一侧，导致出草不齐。(图5-18)培养室在使用前要进行消毒灭菌，通风后使用。

图5-16　接种后的菌瓶

图5-17　北虫草菌丝开始萌发

图5-18　营养液倾向一侧

用固体菌种接种的方法与其他菌类基本相似，这里不再叙述。需要强调的是虽然北虫草的感染力很强，菌丝在培养基内生长很快，但固体菌种在培养基的表面向四周培养基延伸却很慢，而向培养基内部生长较快，在18℃～20℃条件下，布满罐头瓶料面需要20～25天，因此很容易造成料面污染、干燥，而且料面菌丝的菌龄不一致，转色不同期，出草不整齐，从而影响子座的产量。因此，固体菌种接种时要让菌种块在培养基的表面滚动，以增加菌丝与培养基的接触面，这样很快就在培养基表面形成无数的小星状菌落，4～5天后这些星状菌落便连成片状，可起到封面作用。

图5-19　北虫草菌丝已经萌发

采用液体菌种，便可克服这一不足。液体菌种接种后会均匀地分布在培养基表面米粒上，并慢慢渗入分散到各个部位。同时，有一部分液体菌种接种时已到瓶底，因此，在培养料的上、中、下部可同时发菌。(图5-19)8～15天菌丝可布满全瓶。所以，目前，人工栽培北虫草均采用液体菌种。

袋栽的接种方法基本同瓶栽，用液体菌种接种时，将下面的扎绳解开，以相同的菌种量在这道扎绳处的上方注入菌袋内，然后再扎上。