一、酚试剂法测定血清蛋白质含量（改良Lowry法）
【实验目的】
1．学习酚试剂法测定蛋白质含量的原理和方法。
2．掌握标准曲线的制备方法及分光光度计的使用。
【实验原理】
这是根据酚试剂（磷钼酸、磷钨酸为主要成分）与蛋白质中芳香族氨基酸的显色反应及蛋白质与碱性铜试剂和双缩脲反应的复合法。
蛋白质分子中的肽键在碱性溶液中与Cu2＋络合产生紫红色化合物（双缩脲反应）同时使肽链展开，其中带有酚基的酪氨酸残基充分暴露，后者在碱性条件下使酚试剂中磷钨酸和磷钼酸还原生成钼蓝和钨蓝的化合物，其蓝色深浅与蛋白质含量成正比，与已知浓度的标准蛋白质溶液进行比色，即可计算出测定样品中蛋白质的含量。
【实验器材】
试管；100ml容量瓶；50ml容量瓶；分光光度计；血清。
【实验试剂】
1．碱性铜试剂：
甲液：称取无水碳酸钠2．0g，溶于0．1mol／L氢氧化钠溶液100ml中；
乙液：取硫酸铜（CuSO4·5H2O）0．5g溶于1%酒石酸钾溶液100ml中。
临用前取甲液50ml，乙液1ml混合，即为碱性铜试剂。
2．0．9%氯化钠溶液。
3．标准蛋白质溶液（250μg／m1）准确称取标准牛血清清蛋白25mg，溶于0．9%氯化钠溶液中，以容量瓶定容至100ml。
4．酚试剂制备 取钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g和钼酸钠（Na2M0O4·2H2O）25g，溶于700ml蒸馏水中，再加入85%磷酸50ml和浓盐酸100ml混合，置1 500ml圆底烧瓶中温和地回流10h，回流结束后加入硫酸锂（LiSO4·H2O）150g，水50ml，溴3～4滴，除去回流装置，继续沸腾15min，除去剩余的溴。冷却后稀释至1 000ml，过滤，溶液应呈黄色或金黄色（如带绿色者不能使用，应继续加溴煮沸），置于棕色瓶中保存。使用前以酚酞为指示剂，用0．1mol／L氢氧化钠溶液滴定，求出酚试剂的摩尔浓度，然后根据此浓度，将酚试剂用蒸馏水稀释至浓度为1mol／L（滴定时可将酚试剂稀释，以免颜色影响）。试剂放置过久，变成绿色时，可再加溴数滴煮沸15min，如能恢复原有的金黄色，则仍可继续使用。
目前，酚试剂有成品出售。
【实验方法】
1．稀释血清的制备 取血清0．1ml，置50ml容量瓶中，用0．9%氯化钠溶液稀释至刻度处，混匀，此为待测血清样品。
2．测定方法 有标准曲线法和直接计算法。标准曲线法取7支试管按表2－1操作；直接计算法用附表1中1、3、7三支试管操作，分别为空白管、标准管、测定管。操作程序二者完全相同。
附表1 酚试剂法测定蛋白质的操作步骤
混匀，室温放置30min，在波长650nm比色，以l管（空白管）调零，读取各管光吸收值。
以2～6管蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
计算：以7管（测定管）光吸收值查标准曲线，求得血清蛋白质含量。
或按附表1中的3管为标准管进行计算。
【注意事项】
1．各管加入酚试剂后应立即摇匀，不应出现浑浊；
2．碱性铜试剂必须新鲜配制；
3．标准蛋白质溶液需先用凯氏定氮法测定其蛋白质纯度，然后进行配制；
4．本实验对不同蛋白质定量变动较大，凡具有还原性的物质对此实验都有干扰。
二、考马斯亮蓝G－250染料结合比色法测定蛋白质含量
【实验目的】
1．学习考马斯亮蓝G－250染料结合比色法测定蛋白质含量的原理和方法。
2．掌握标准曲线的制备及分光光度计的使用。
【实验原理】
考马斯亮蓝G－250（coomassie brilliant blue，G－250）为醇溶性蛋白质染料。在酸性环境中，蛋白质带正电荷（－NH＋3）与考马斯亮蓝G－250阴离子结合为蓝色的“染料－蛋白质”复合物，其最大吸收峰为595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，其光吸收值与蛋白质浓度成正比。本法适用于测定10～100μg的不同浓度蛋白质溶液。
【实验器材】
试管；分光光度计。
【实验试剂】
1．考马斯亮蓝G－250染色液 准确称取考马斯亮蓝G－250 100mg溶于25ml甲醇中，加水800ml，加85%磷酸（W／V，A·R）100ml，混匀，再加水至1 000ml，置棕色瓶内，于4℃冰箱保存可用1个月。
2．标准蛋白质溶液 每毫升含标准蛋白质1 000μg（多用标准的牛血清清蛋白或人血清清蛋白。若测定人血清蛋白质含量，可用正常人混合血清经凯氏定氮法测定蛋白质含量后，稀释应用）。
【实验方法】
1．制备标准蛋白稀释系列 首先取试管5支，按附表2操作。
附表2 标准蛋白稀释液制备
2．绘制标准曲线 另取7支试管，编号为0，1＇～6＇，按表附表3操作：
附表3 蛋白含量测定的操作步骤
将以上试管内试液摇匀，静置2min，于波长595nm以空白管调零，读取各管光吸收值。以1′～5′管的蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。
3．检测液蛋白含量计算 以6′管光吸收值查标准曲线，求出待测样品中蛋白质含量。
【注意事项】
1．本法操作简便、灵敏、重复性好，而且显色迅速，约2min内即可与蛋白质充分结合，至少1h内呈色稳定。随时间延长，“染料－蛋白质”复合物会逐渐形成细小颗粒，以至沉淀。
2．不同蛋白质在同样酸性条件下所带正电荷量不同，故与染料结合的程度也不同，以至同一浓度的不同蛋白质显色度有差异。为此要求蛋白质标准品要纯；标准品与染料结合的色调和待测样品与染料结合的色调要相似。
3．蛋白质与本试剂反应时只需轻轻摇匀即可，切勿剧烈震荡，以防产生泡沫，降低颜色深度。
4．比色杯上染料的清洗方法用甲醇、乙醇或其他有机溶剂（如氯仿、丙酮）清洗，也可用0．1mol／L HCl浸泡，数小时后蓝色黏附物即可除去。
5．此法只适用于可溶性蛋白，对于膜结合蛋白、细胞及细胞器等，则需用酸碱或去污剂处理后方可测定。
（杨江苏）
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