老化度的测定

一、实验原理

淀粉在水中受热糊化时会发生颗粒膨胀，黏度上升等各种质变。通常以淀粉酶的分解性的变化为指标来反映淀粉的糊化程度。本法采用对生淀粉完全不分解的β－淀粉酶和对支链淀粉的立体结构变化十分敏感的异淀粉酶的混合酶系来测定糊化淀粉和老化淀粉的程度，从而了解淀粉性食品在贮藏中的老化程度。

二、实验材料与试剂

(1)材料:玉米淀粉与大豆淀粉。

(2)试剂:

①酶试剂:大豆β－淀粉酶(粗酶制剂5IU/mg);雪白根霉糖化酶(22IU/mg)，黑曲霉糖化酶(液状，3800IU/mg)，异淀粉酶(粗制品2IU/mg)。

②酶的失活处理:将酶置于沸水浴中保温10min。

三、实验步骤

(1)测定说明:反应生成的还原糖用Somogyi-Nelson法或其他方法测定。总糖量用酚－硫酸法或斐林法测定。对于酶活性的测定方法:糖化酶和β－淀粉酶以2%可溶性淀粉(pH 4．8和6．0)为底物。加一定量酶液;异淀粉酶是以2%支链淀粉液(pH6．0)为底物，加酶液于40℃下反应。用Somogyi-Nelson或其他方法来测定增加的还原糖量。酶活性以国际单位(IU)表示。在它们各自的最适反应条件下，1min内切断1μg分子的葡萄糖苷键所需要的酶量定为一个单位(IU)

(2)底物的配制:将5%玉米淀粉和大豆淀粉的悬浮液置于沸水浴中预先糊化10min后，于121℃加压蒸煮15min，得到完全糊化、分散的样品。将上述的糊化液分别在室温冷藏库(5℃)和冷冻库(－20℃)中老化，或者直接得到贮藏已久的老化淀粉性食品，作为老化淀粉的试样。另外，在以上两种样品中各加入三倍量的无水酒精进行脱水。此操作重复三次，最后用丙酮脱水制成干燥样品。

(3)酶溶液和反应条件，将170mg异淀粉酶、17mgβ－淀粉酶溶解于100mL0．8mol/L醋酸缓冲液中(pH6．0)，滤去不溶部分。滤液每毫升含异淀粉酶3．4IU、β－淀粉酶0．8IU。雪白根霉和黑曲霉的糖化酶是按一般方法制备。糖化酶的用量，除特别注明外，匀使用每毫升含有0．22IU的酶液。完全糊化样品是将脱水的糊化老化淀粉用10mol/L氢氧化钠处理，使其全完糊化，供测定用。

(4)测定步骤:将80mg脱水粉未样品(若是淀粉糊样品，则取相当于80mg淀粉的量)置于玻璃均化器内，加入8mL水进行分散。取2只25mL容量瓶，分别加入2mL均匀样品。其中一只用0．8mol/L醋酸缓冲液(pH6．0)定容，作为试料样品。另一个容量瓶中加入0．2mL10mol/L氢氧化钠溶液，在50℃水浴中保温5min，使淀粉完全糊化，再加1mL 2mol/L醋酸，使溶液的pH为6．0，然后用0．8mol/L醋酸缓冲溶液定容至25mL，作为完全糊化样品。取供试样品4mL，加入1mLβ－淀粉酶－异淀粉酶混合液，置于40℃恒温槽中振荡反应30min，同时加入1mL失活的酶液，在同一条件下反应作为空白。反应结束后，取1mL反应液置于沸水浴中5min，使酶失活，再稀释5倍。取1mL稀释液用Somogyi-Nelson法测定还原力，取0．5mL用酚一硫酸法测定总糖量。

(5)糊化度、老化度的表示。

糊化度是以完全糊化样品的分解度为100时，被检测溶液的分解度除以100来表示。老化度是以糊化度的减少来表示。

四、结果计算

式中:A——未糊化样品还原糖生成量(μg);

A1——糊化样品还原糖生在量(μg);

B——未糊化样品的总糖量(μg);

B1——糊化样品的总糖量(μg);

a——空白对照数。