食品中β－胡萝卜素的测定

许多植物如胡萝卜、番茄、绿叶蔬菜、玉米含类胡萝卜素物质，如α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、隐黄质、叶黄素等。以胡萝卜为食物的家禽、家畜、水产动物及其加工产品以及为着色而添加胡萝卜素的食品也含有胡萝卜素。有些类胡萝卜素在人体内可转变为维生素A，故称为维生素A原，β-胡萝卜素含有两个维生素A1的结构，转换率最高。

胡萝卜素对热及酸、碱比较稳定，紫外线和空气中的氧可促进其氧化破坏。属脂溶性维生素，可用有机溶剂从食物中提取。

胡萝卜素本身是一种色素，在450nm波长处有最大吸收，只要能完全分离，便可定性和定量。但在植物体内，胡萝卜素经常与叶绿素、叶黄素等共存，在提取β-胡萝卜素时，这些色素也能被有机溶剂提取，因此在测定前，必须将胡萝卜素与其他色素分开。常用的方法有高效液相色谱法、纸层析、柱层析和薄层层析法。

1.高效液相色谱法

1)原理

试样中的β-胡萝卜素，用石油醚+丙酮(80+20)混合液提取，经三氧化二铝柱纯化，然后以高效液相色谱法测定，以保留时间定性，峰高或峰面积定量。

2)试剂

①石油醚: 沸程30～60℃。

②甲醇: 色谱纯。

③丙醇。

④己烷。

⑤四氢呋喃。

⑥三氯甲烷。

⑦乙腈: 色谱纯。

⑧三氧化二铝: 层析用，100～200目，140℃活化2h，取出放入干燥器备用。

⑨含碘异辛烷溶液: 精确称取碘1mg，用异辛烷溶解并稀释至25m L，摇匀备用。

⑩α-胡萝卜素标准溶液: 精确称取1mgα-胡萝卜素，加入少量三氯甲烷溶解，然后用石油醚溶解并洗涤烧杯数次，溶液转入25m L容量瓶中，用石油醚定容，浓度为40μg/m L，于-18℃储存备用。

3)仪器

①高效液相色谱仪。

②离心机。

③旋转蒸发仪。

4)分析步骤

(1)试样提取

①淀粉类食品: 称取10.0g试样于25m L带塞量筒中(如果试样中β-胡萝卜素量少，取样量可以多些)，用石油醚或石油醚+丙酮(80+20)混合液振摇提取，吸取上层黄色液体并转入蒸发器中，重复提取直至提取液无色。合并提取液，于旋转蒸发器上蒸发至干(水浴温度为30℃)。

②液体食品: 吸取10.0m L试样于250m L分液漏斗中，加入石油醚+丙酮(80+20)20m L提取，然后静置分层，将下层水溶液放入另一分液漏斗中再提取，直至提取液无色为止。合并提取液，于旋转蒸发器上蒸发至干(水浴温度为40℃)。

③油类食品: 称取10.0g试样于25m L带塞量筒中，加入石油醚+丙酮(80+20)提取。反复提取，直至上层提取液无色，合并提取液，于旋转蒸发器上蒸发至干。

(2)纯化

将试样提取液残渣，用少量石油醚溶解，然后进行氧化铝层析。氧化铝柱为1.5cm(内径) ×4cm(高)。先用洗脱液丙酮+石油醚(5+95)洗氧化铝柱，然后再加入溶解试样提取液的溶液，用丙酮+石油醚(5+95)洗脱β-胡萝卜素，控制流速为20滴/min，收集于10m L容量瓶中，用洗脱液定容至刻度。用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液作HPLC分析用。

(3)测定

①HPLC参考条件: 色谱柱: Spherisorb C18柱4.6mm×150mm; 流动相: 甲醇+乙腈(90+10); 流速: 1.2m L/min; 波长: 448nm。

②试样测定: 吸取已纯化的溶液20μL依法操作，从标准曲线查得或回归求得所含β-胡萝卜素的量。

③标准曲线: 分别进标准使用液20μL，进行HPLC分析，以峰面积对β-胡萝卜素浓度作标准曲线。

5)结果计算

式中: X——试样中β-胡萝卜素的含量，(g/kg或g/L);

V——定容后的体积，(m L);

c——试样中β-胡萝卜素的浓度(在标准曲线上查得)，μg/m L;

m——试样的量，g或m L。

6)说明及注意事项

①胡萝卜素是维生素A的前体，6μgβ-胡萝卜素相当于1μg维生素A。

②高效液相色谱法检出限为5.0mg/kg(L)，线性范围为0～100mg/L。

③在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

2.纸层析法

1)原理

试样经皂化后，用石油醚提取食品中的胡萝卜素及其他植物色素，以石油醚为展开剂进行纸层析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色素分离，剪下含胡萝卜素的区带，洗脱后于450nm波长下定量测定。

2)试剂

①石油醚(沸程30～60℃): 同时是展开剂。

②氢氧化钾溶液(1+1): 取50g氢氧化钾溶于50m L水。

③无水硫酸钠。

④无水乙醇: 不得含有醛类物质。

用银镜反应进行检验: 加2 m L银氨液于试管内，加入几滴乙醇摇匀，加入少许2.5mol/L氢氧化钠溶液加热。如乙醇中无醛，则没有银沉淀，否则有银镜反应。

银氨液配制: 加浓氨水于5%硝酸银液中，直至氧化银沉淀溶解，加入2.5mol/L氢氧化钠溶液数滴，如发生沉淀，再加浓氨水使之溶解。

乙醇脱醛方法: 取2g硝酸银溶于少量水中，取4g氢氧化钠溶于温乙醇中，将两者倾入1L乙醇中，暗处放置两天并经常摇动，促进反应，过滤，滤液倾入蒸馏瓶中蒸馏，弃去初蒸的50m L。乙醇中含醛较多时，硝酸银用量适当增加。

⑤β-胡萝卜素标准溶液制备

a.β-胡萝卜素标准贮备液: 准确称取50.0mgβ-胡萝卜素标准品，溶于100.0m L三氯甲烷中，浓度约为500μg/m L，准确测其浓度。标定浓度的方法如下:

取标准贮备液10.0μL，加正己烷3.00m L，混匀并测其吸光度值，比色杯厚度为1cm，以正己烷为空白，入射光波长450nm，平行测定三份，取平均值。

b.β-胡萝卜素标准使用液: 将已标定的标准液用石油醚准确稀释10倍，使每毫升溶液相当于50μg，避光保存于冰箱中。

c.胡萝卜素溶液浓度计算公式:

式中: X——胡萝卜素标准溶液浓度，μg/m L;

A——吸光度值;

E——β-胡萝卜素在正己烷溶液中，入射光波长450nm、比色杯厚度1cm、溶液浓度为1mg/L的吸光系数，为0.2638;

3.01/0.01——测定过程中稀释倍数的换算系数。

3)仪器

①玻璃层析缸。

②分光光度计。

③旋转蒸发器: 具配套150m L球形瓶。

④恒温水浴锅。

⑤皂化回馏装置。

⑥点样器或微量注射器。

⑦定性滤纸: 18cm×30cm，快速或中速。

4)分析步骤

(1)试样预处理

①皂化: 取适量试样，相当于原样1～5g(含胡萝卜素为20～80μg)匀浆，粮食试样视其胡萝卜素含量而定，植物油和高脂肪试样取样量不超过10g。置100m L带塞锥形瓶中，加脱醛乙醇30m L，再加10m L氢氧化钾溶液(1+1)，回流加热30min，然后用冰水使之迅速冷却。皂化后试样用石油醚提取，直至提取液无色为止，每次提取石油醚用量为15～25m L。

②洗涤: 将皂化后试样提取液用水洗涤至中性。将提取液通过盛有10g无水硫酸钠的小漏斗，漏入球形瓶，用少量石油醚分数次洗净分液漏斗和无水硫酸钠层内的色素，洗涤液并入球形瓶内。

③浓缩与定容: 将上述球形瓶内的提取液于旋转蒸发器上减压蒸发，水浴温度为60℃，蒸发至约1m L时，取下球形瓶，用氮气吹干，立即加入2.00m L石油醚定容，备层析用。

(2)纸层析

①点样: 在18cm ×30cm滤纸下端距底边4cm处作一基线，在基线上取A，B，C，D四点，吸取0.100～0.400m L浓缩液在AB和CD之间迅速点样。

②展开: 待纸上所点样液自然挥发干后，将滤纸卷成圆筒状，置于预先用石油醚饱和的层析缸中，进行上行展开。

③洗脱: 待胡萝卜素与其他色素完全分开后，取出滤纸，自然挥发干石油醚，将位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带剪下，立即放入盛有5m L石油醚的具塞试管中，用力振摇，使胡萝卜素完全溶入试剂中。

(3)测定

用1cm比色杯，以石油醚调零点，于450nm波长下，测吸光度值。以其值从标准曲线上查出β-胡萝卜素的含量，供计算时使用。

标准工作曲线绘制: 取β-胡萝卜素标准使用液(浓度为50μg/m L)1.00m L，2.00m L， 3.00m L，4.00m L，6.00m L，8.00m L，分别置于100m L具塞锥形瓶中，按试样分析步骤进行预处理和纸层析，点样量为0.100m L，标准曲线各点含量依次为2.5μg，5.0μg，7.5μg， 10.0μg，15.0μg，20.0μg。为测定低含量试样，可在0至2.5μg间加做几点，以β-胡萝卜素含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

5)结果计算

式中: X——试样中胡萝卜素的含量(以β-胡萝卜素计)，μg/100g;

m1——在标准曲线上查得的胡萝卜素质量，μg;

V1——点样体积，m L;

V2——试样提取液浓缩后的定容体积，m L;

m——试样质量，g。

6)说明及注意事项

①通常标准品不能全溶解于有机溶剂中，必要时应先将标准品皂化，再用有机溶剂提取，用蒸馏水洗涤至中性后，浓缩定容，再进行标定。由于胡萝卜素很容易分解。所以每次使用前，所用标准品均需标定，在测定试样时需带标准品同步操作。

②纸层析法检出限为0.11μg。

③从试样处理到分析要在避光条件下进行。

④该法不能区分α-胡萝卜素、β-胡萝卜素和γ-胡萝卜素，标准品是β-胡萝卜素，但实际结果为总胡萝卜素。

⑤在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。