实验一 培养基的配制
一、目的要求
1．掌握配制培养基的一般方法和步骤。
2．了解常用的培养基及其作用。
二、实验原理
培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中，微生物种类繁多、营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、无机盐、生长因素等。不同微生物对pH要求不一样，霉菌和酵母的培养基的pH一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的pH一般为中性或微碱性的（嗜碱细菌和嗜酸细菌例外）。所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的范围。
此外，由于配制培养基的各类营养物质和容器等含有各种微生物，配制好的培养基必须立即灭菌，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱度所带来不利的影响。
根据微生物的种类和实验目的不同，培养基分为天然培养基、合成培养基、半合成培养基；按培养基的物理状态分为固体培养基（含1．5～2．0%琼脂，可供微生物的分离、鉴定、活菌计数、菌种保藏等用）、半固体培养基（含0．5～0．7%琼脂，常用来观察细菌运动的特征、菌种保存等）、液体培养基；按用途分为基础培养基（如肉汤培养基）、加富培养基（如血平板和巧克力平板）、鉴别培养基（如EMB培养基）、选择培养基（如SS培养基）等。
目前已有各种商品化的“干燥培养基”成品出售。这种培养基是将新鲜配制的液体培养基用喷雾干燥法、真空干燥法、低温干燥法或蒸发干燥法等将培养基内所含的水分去掉；或将培养基内的各种固形成分经适当处理、充分混匀，制成干燥粉末而成。使用时只要按比例加入一定量的水，经溶解、分装，高压蒸汽灭菌，即可使用。这种培养基的优点是配制省时，携带方便，使用简易，质量稳定。
培养基制备的基本过程包括调配成分、溶解、校正pH、是容过滤澄清、分装、灭菌、质量检查和保存。
（1）调配成分：按培养基处方用量准确称取各种成分。
（2）溶解：加适量蒸馏水使其充分溶解，必要时可稍稍加热，定容。
（3）校正pH：一般将培养基的pH调至7．2～7．6之间。经高压灭菌后其pH可发生0．1～0．2的变动。若用NaOH校正，高压灭菌后pH下降0．1～0．2；若用Na2CO3校正，高压灭菌后pH升高0．1～0．2。
（4）过滤澄清：自配的培养基通常有一些混浊或沉淀，需过滤澄清后方可使用。液体或半固体培养基常用滤纸过滤，固体培养基在熔化后趁热用绒布或双层纱布加脱脂棉过滤。
（5）分装：①基础培养基，一般分装于容量为500mL锥形瓶灭菌后备用，以便随时倾注制平板或配制营养培养基等；②琼脂斜面：通常在融化后分装于试管，量为试管高度的1/4～1/3，加塞后灭菌，趁热摆成斜面；③半固体培养基：分装量为试管容量的1/4～1/3，加塞灭菌后趁热直立凝固；④琼脂高层培养基；分装量为管长的2/3（接种厌氧菌用），灭菌后趁热直立凝固；⑤琼脂平板：先将灭菌琼脂融化后冷却至50℃左右，以无菌操作倾注于灭菌平皿内（内径90mm的平皿，13～15mL），轻轻摇匀，待琼脂凝固后将平皿翻转，置4℃保存备用。
（6）灭菌：①由耐热物质配制成的培养基（如普通营养琼脂等）常用高压蒸汽灭菌，条件为0．1MPa（1．05kg/cm2），121．3℃，15～20min；含糖培养基以0．06MPa（0．59kg/cm2），112．6℃，10～15min为宜，以免破坏糖类物质；②不耐高热的物质配制成的培养基，如糖类、明胶和牛乳等常用流通蒸汽灭菌，方法是加温到80～100℃，30min，每天1次，连续3天；③富含蛋白质的培养基（如含血清或鸡蛋清的培养基）需用血清凝固器灭菌，方法是将配制好的培养基摆放在血清凝固器内（一般做成斜面）灭菌，第1天75℃，30min，第2天80℃，30min，第3天85℃，30min，在3次灭菌的间隙将培养基取出，置35℃孵箱中过夜；④对高营养液态的不耐热培养基，如血清、细胞培养液等，则可用过滤除菌。
（7）质量检查：须做无菌试验和效果试验。①无菌试验；将灭菌后的培养基置35℃孵育24h，无任何细菌生长为合格；②效果试验：将已知的标准参考菌株接种于待检培养基中，检查细菌的生长繁殖状况和生化反应是否与预期的结果相符合。
（8）保存：制备好的培养基应注明名称、制作日期，如琼脂平板应将底在上盖在下（带培养基的平皿），用牛皮纸包裹或装于保鲜袋内，以减少水分蒸发。液体培养基应直立放置，制作好的培养基应存放于冷暗处或4℃冰箱。
下面介绍几种常用培养基：
（1）牛肉膏蛋白胨培养基（肉汤培养基）。牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨和氯化钠。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而氯化钠提供无机盐。由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。
牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：
根据需要加入1．5%～2．5%（一般为1．8%）的琼脂成营养琼脂，加入0．2%～0．7%（一般为0．5%）琼脂，则成半固体培养基。
（2）血液琼脂培养基（巧克力琼脂）。血液琼脂培养基是一种含有脱纤维动物血（一般用兔血或羊血）的牛肉膏蛋白胨培养基。因此除培养细菌所需要的各种营养外，还能提供辅酶、血红素等特殊生长因子。因此血液琼脂培养基常用于培养、分离和保存对营养要求苛刻的某些病原微生物。此外，这种培养基还可用来测定细菌的溶血作用。
血液琼脂培养基的配方如下：
按牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（营养琼脂）方法制备、分装、灭菌后，待培养基冷却至45～50℃时，以无菌操作加入无菌脱纤维血至10%（临用前37℃水浴预温30min），立即摇匀（避免产生气泡），分装于无菌试管和平皿内，凝固后即成血液琼脂斜面或血液琼脂平板。
若基础培养基温度在70～80℃时加入血液，并在80℃水浴中摇匀15～20min，倾注于平板后即成巧克力琼脂平板。如图1－1所示。
图1－1 血平板和巧克力平板
三、实验内容及方法
（一）肉汤培养基（营养琼脂）的制备
1．材料。
牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、蒸馏水、量筒、电子秤、试管、试管帽、锥形瓶等。
2．方法。
（1）称量：（4人一组）。
根据培养基配方（牛肉膏3%、蛋白胨10%、氯化钠5%），按500mL的用量准确称取各试剂，加入适量蒸馏水充分溶解，定容，调pH到7．2～7．6。
（2）分装：（4人分为A组和B组）。
A组：配半固体培养基。取30mL稀释后培养液加0．5%琼脂，加热溶解，分装小试管10支，每支3mL；
液体培养基。取20mL稀释后培养液分装小试管6支，每支3mL。
B组：配斜面培养基。取30mL稀释后培养液加1．8%琼脂，加热溶解，分装中试管5支，每支6mL；
配液体培养基。取20mL稀释后培养液分装小试管6支，每支3mL。
剩余400mL培养液置500mL锥形瓶中，加1．8%琼脂。
（3）包扎、标记。标记内容：培养基种类、班级、姓名、日期。
（4）湿热高压灭菌。121℃，20min进行灭菌。
（5）摆斜面。实验台上放一木条，厚度为1cm左右。将试管头部枕在木条上，使管内培养基自然倾斜，凝固后即成斜面培养基。
（6）倒平板。将刚刚灭过菌的盛有培养基的锥形瓶和培养皿放在实验台上，点燃酒精灯，右手托起锥形瓶瓶底，左手拔下塞子，将瓶口在酒精灯上稍加灼烧，左手打开培养皿盖，右手迅速将培养基倒入培养皿中，每皿约倒入15mL（以铺满皿底为度），平放在台子上，待培养基凝固后，进行无菌检测。
（7）无菌检测。将灭菌完成后的培养基置37℃，孵育24h，若无菌生长则菌检合格，可以使用。
3．结果记录及分析。
记录所配培养基情况，并分析原因。
四、思考与讨论
1．培养基调配溶解。先在锥形瓶底加入少量水，再加入蛋白胨等成分，以防其粘瓶底烧结。制备大量培养基，除玻璃容器外，还可用搪瓷缸，但不可用铁、铜容器，以免铁、铜离子进入培养基；因培养基中含铁量超过0．14mg/L时可抑制细菌毒素的产生，含铜量超过0．3mg/L时可抑制细菌生长。需在培养基中加染料、胆盐、指示剂等，应在校正pH后加入。
2．培养基的澄清。如需要制备十分澄清的培养基，可用卵蛋白加热澄清法。其方法为：取一个蛋的卵蛋白加水20mL，搅拌至出现泡沫，倒入1000mL液体或熔化的固体培养基中混匀，然后在流动蒸汽中加热30～60min，使培养基中不溶性物质附着于凝固蛋白，取出后以纱布夹脱脂棉（固体培养基）或滤纸（液体或半固体培养基）过滤即可。
3．斜面摆放。斜面摆放若培养基温度过高，凝固过程中遇外界温差过大形成大量冷凝水留在斜面底部，影响细菌生长，而且容易污染。必要时刻在斜放的试管上覆盖纱布保温，减少温差，自然冷却。
一般制作斜面培养基时，每支Φ15×150mm的试管，装3～4mL（1/4～1/3试管高度），摆放后斜面的长度不超过试管长度的1/2为宜。
4．平板的倾注。倾注培养基时，切勿将皿盖全部开启，以免空气中尘埃及细菌等微生物落入。倾注时若培养基温度过高，则冷凝水过多，易致污染，不易分离到菌落；若温度过低，部分琼脂凝固，倾注时平板表面会高低不平。可在无菌室或接种罩内倾注培养基后，将皿盖稍开一缝隙，在紫外灯照射下待凝，这样利于蒸汽散发，减少平板内冷凝水。
倾注血液琼脂时，由于加血时琼脂表面容易产生气泡，倾注时适时转动锥形瓶，使气泡附于瓶壁，以减少血平板表面的气泡。
免责声明：以上内容源自网络，版权归原作者所有，如有侵犯您的原创版权请告知，我们将尽快删除相关内容。
