火箭免疫电泳

实验15　火箭免疫电泳

(Rocket immunoelectrophoresis)

【目的】

了解火箭免疫电泳技术。

【原理】

火箭免疫电泳(rocket immunoelectrophoresis)又称单向定量免疫电泳。在琼脂内掺入适量的抗体，在电场作用下，定量的抗原泳动遇到琼脂内的抗体，形成抗原-抗体复合物沉淀下来。走在后面的抗原继续在电场作用下向正极泳动，遇到琼脂内沉淀的抗原-抗体复合物，抗原量的增加造成抗原过量，使复合物沉淀溶解，一同向正极移动而进入新的琼脂内与未结合的抗体结合，又形成新的抗原-抗体复合物沉淀下来，不断地沉淀-溶解-再沉淀，直至全部抗原和抗体结合，在琼脂内形成锥形的沉淀峰，称火箭电泳。火箭峰的长度与标准抗原比较，可计算待测抗原的浓度。

本实验以人血清作为抗原，免疫动物(家兔)产生抗血清，当适量抗原、抗体在琼脂糖中扩散，两者相遇时，则形成抗原-抗体复合物的白色沉淀线。不同的抗原分子与相应的抗体分子的扩散速度不同，当两者间比例适当时，出现数目不同的沉淀线，根据沉淀线的出现可以定性抗原、诊断疾病或测定抗体的效价。

【材料】

1.抗原:胎甲球蛋白(1～5mg/ml)。

2.免疫血清(抗血清):家兔抗人胎甲球蛋白血清。

3.琼脂糖(或进口分装琼脂粉)。

4. pH 8.6电极缓冲液(巴比妥缓冲液)(离子强度0.05m):取巴比妥1.84g，巴比妥钠10.3g溶于蒸馏水，定溶至1L。制备琼脂溶液时需要将上述缓冲稀释一倍，离子强度为0.025m。

5.载玻片、打孔器、微量取液器、稀释板、培养器或带盖培养皿。

【方法】

1.抗体琼脂板的制备:将融化的琼脂冷却到55℃，加入适量(看免疫血清的效价高低而定)的抗体，立即混匀(不要出现泡沫)，将上述的抗体琼脂(大约20ml)制成琼脂板，冷却后按图15-1所示打孔备用。

2.加样:在各孔里加入不同稀释度的抗原。

3.电泳:在平板电泳槽里倒进离子强度m= 0.05的巴比妥缓冲液。将凝胶板平放在电泳槽中的隔板上。琼脂的两端用浸湿的滤纸做桥与电泳槽的电极缓冲液相连接，抗体端接正极。通电，电流强度按琼脂板的宽度计算(1～2mA/cm)。观察到白色沉淀线时，即电泳完毕(一般1h左右)。一般通电后调电压为10V/cm，或电流强度为2～4mA/cm，时间为1～5h。

4.抗原定量:在电泳一定时间后可以观察到火箭状的白色沉淀峰。电泳完毕后可以用肉眼观察并量出已知抗原量的各个火箭的高度，绘出标准曲线，便可测出未知浓度的抗原量。如果精确计算，可用求积仪测定峰的面积。

图15-1　火箭电泳示意图

【注意事项】

1.影响单向定量免疫电泳的因素很多，主要是要选择好抗体浓度，使抗原和抗体浓度比例合适。这就需要根据免疫血清的效价来定所加入琼脂中的抗体量，如效价高，则免疫血清琼脂的比例为1∶5～1∶9，如效价低，则免疫血清与琼脂的比例为2∶5。

2.加入的抗体量要合适，以保证抗原、抗体的合适比例，以便形成清晰的沉淀峰。抗体的准确用量应通过预实验来决定，即:加入不同量的抗血清，用一定量的抗原进行火箭电泳，选出沉淀峰在2～5cm之间的相应抗体浓度就是合适的抗体用量。

3.所用琼脂可选择无电渗或电渗很小的，否则火箭形状不规则。

4.注意电泳终点时间，如火箭电泳顶部呈不清晰的云雾状或圆形皆提示未达终点。

5.标本数量多时，电泳板应先置电泳槽上，搭桥并开启电源(电流要小)后再加样品。否则易形成宽底峰形，使定量不准。

6.作IgG定量测定时，由于抗原和抗体的性质相同，火箭峰因电渗呈纺锤状。为了纠正这种现象，可用甲醛与IgG上的氨基结合(甲酰化)，使本来带两性电荷的IgG变为只带负电荷，加快了电泳速度，抵消了电渗作用，而出现伸向阳极的火箭峰。

7.火箭电泳作为抗原定量只能测定Mg/ml以上的含量，如低于此水平则难以形成可见的沉淀峰。加入少量¹²⁵I标记的标准抗原共同电泳，则可在含抗体的琼脂中形成不可见的火箭峰;经洗涤干燥后，用X线胶片显影，可出现放射性显影，这是目前采用较多的放射自显影技术。根据自显影火箭峰降低的程度(竞争法)可计算出抗原的浓度。放射免疫自显影技术可测出ng/ml的抗原浓度。

【思考题】

简述火箭免疫电泳的原理。