高效液相色谱法测定食品中防腐剂和甜味剂

^＊实验28　高效液相色谱法测定食品中防腐剂和甜味剂

一、目的

学习高效液相色谱法（HPLC）的基本原理，了解HPLC仪器的基本结构和使用方法，初步学会HPLC仪器的基本操作技能。通过对食品中防腐剂和甜味剂的高效液相色谱分析，理解反相色谱的原理和应用，掌握HPLC分析的定性和校准曲线定量方法。

二、内容提要

HPLC是以液体为流动相，采用细颗粒的高效固定相填料的柱色谱分离技术。固定相通常用特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的，现在大多采用化学键合固定相，如C₁₈、C₈、氨基柱、氰基柱和苯基柱等。分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程可以认为是一个分配平衡的过程。按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法和反相色谱法。

在正相键合相色谱法中，键合固定相的极性大于流动相的极性，常采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正己烷、环己烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节流动相的极性，从而改变组分的保留时间。本方法适用于分离油溶性或水溶性的极性与强极性化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。

在反相键合相色谱法中，键合固定相的极性小于流动相的极性，一般用非极性固定相（如C₁₈、C₈）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节流动相的极性，从而改变保留时间。本方法适用于分离非极性和极性较弱的化合物，其应用范围比正相色谱法广泛得多。据统计在高效液相色谱法中，约70％～80％的分析任务是由反相键合相色谱法来完成的。

防腐剂可以抑制食品中微生物的繁殖或杀灭微生物，防止食品腐败，保持食品的鲜度和良好品质。苯甲酸和山梨酸及其盐类都是常用食品防腐剂，糖精钠是食品中常用的人工甜味剂。

1）苯甲酸（Benzoic Acid）又称安息香酸，苯蚁酸，苯酸

2）山梨酸（Sorbic Acid）又称清凉茶酸，2，4－己二烯酸，2－丙烯基丙烯酸

3）糖精钠（Saccharin Sodium）又称可溶性糖精钠，邻苯甲酰磺酰胺钠

随着人们对绿色食品的要求不断提高，这些食品添加剂的食用毒性一直为人们所关注。我国食品卫生标准规定苯甲酸和山梨酸在饮料中最大使用量均为0.2g·kg^－1。糖精钠是人工甜味剂，在部分发达国家已被禁用，我国限制糖精钠在饮料中最大使用量为0.15g· kg^－1。目前，我国对以上3种食品添加剂测定的标准方法有薄层色谱法、气相色谱法及高效液相色谱法。前两种方法一般都是将添加剂进行分别提取后测定，而高效液相色谱法则对各种添加剂可同时测定，具有高效、高速、高灵敏度及高自动化等特点。本实验采用高效液相色谱配合多波长紫外检测器，用反相色谱技术同时测定上述3种食品添加剂，利用保留值定性，外标法定量。

三、仪器和试剂

1.仪器

Agilent HPLC 1100高效液相色谱仪（仪器配置：在线脱气机、四元泵、多波长紫外检测器、柱温箱、手动进样器、20μL HPLC进样环、50μL HPLC微量注射器）

玻璃溶剂过滤器

超声波发生器

容量瓶　25mL 5个，50mL 5个，100mL1个

移液管　10mL 1支

吸量管　5mL，2mL，1mL各1支

烧杯　50mL，100mL，500mL各1个

样品过滤头、溶剂过滤膜（0.45μm）等

2.试剂

甲醇，色谱纯，使用前用0.45μm有机相滤膜过滤。

乙酸铵溶液　0.02mol·L^－1：用新鲜去离子水配制，使用前用0.45μm水相滤膜过滤

苯甲酸标准储备液　1mg·mL^－1

山梨酸标准储备液　1mg·mL^－1

糖精钠标准储备液　1mg·mL^－1

Carrez试剂Ⅰ：取15g K₄［Fe（CN）₆］·3H₂O，用水溶解并稀释至100mL

Carrez试剂Ⅱ：取30g ZnSO₄·7H₂O，用水溶解并稀释至100mL

乙酸铵 2.0mol·L^－1

氨水（1∶1）：1体积浓氨水加1体积水

样品Ⅰ（碳酸型饮料，如雪碧、美年达、健力宝等汽水、可乐）

样品Ⅱ（酒，如葡萄酒、果酒等）

样品Ⅲ（乳制品，如酸牛奶、调味牛奶等）

四、实验步骤

1.样品溶液的制备

1）样品Ⅰ。取40～50mL液体样品于50mL干燥的烧杯中，超声脱气10min后准确吸取5mL于50mL容量瓶中，加入适量水，加1.0mL 2.0mol·L^－1乙酸铵，加Carrez试剂Ⅰ、Ⅱ各1.0mL，加水至刻度、混匀，静置10min，进样分析前用一次性针筒吸取上层清液并经样品过滤头（0.45μm）过滤后使用。

2）样品Ⅱ。如样品中不含CO₂气体，则可省略超声除气步骤，其他步骤与样品Ⅰ脱气后的处理方法相同。

3）样品Ⅲ。如样品呈酸性，先用氨水（1∶1）调至中性，其他步骤与样品Ⅰ脱气后的处理方法相同。

2.系列标准溶液的配制

（1）混合系列标准溶液的配制

1）混合标准溶液（100mg·L^－1）的配制。准确吸取苯甲酸、山梨酸和糖精钠标准储备液（1mg·mL^－1）各10mL于1个100mL容量瓶中，用水稀释至刻度。

2）混合系列标准溶液的配制。分别准确吸取100mg·L^－1混合标准溶液1、2、3、4及5mL于5个25mL容量瓶中，用0.02mol·L^－1乙酸铵溶液定容至刻度，即配成均含苯甲酸、山梨酸和糖精钠为4、8、12、16及20mg·L^－1的混合系列标准溶液。

（2）标准加入法工作溶液的配制

在4个50mL容量瓶中，各准确加入经超声脱气后的5mL液体样品，然后依次加入0.00、1.00、3.00及5.00mL混合标准溶液（100mg·L^－1），各加1.0mL 2.0mol·L^－1乙酸铵，Carrez试剂Ⅰ、Ⅱ各1.0mL，加水至刻度、混匀，静置10min。进样分析前用一次性针筒吸取上层清液并经样品过滤头（0.45μm）过滤后使用。

3.液相色谱仪的调试和操作

（1）色谱条件

色谱柱　Aglient ZORBAX Eclipse XDB－C8 4.6mm×150mm×5μm

流动相　甲醇∶乙酸铵溶液（0.02mol·L^－1）的体积比为5∶95

流量　1mL·min^－1

柱温　25℃

检测波长　205nm

进样量　20μL

（2）仪器操作

详见附录中Angilent 1100HPLC的日常开机步骤及Agilent 1100化学工作站的使用。

4.测定

用被测样品润洗过的50μL专用进样针吸取40～50μL上述试样（大于进样环2～3倍量）在“Load”位置推针后，扳动手动进样阀至“Inject”位置，再拔出进样针。即开始数据采集。依次将下列样品按上述方法进样。

1）分别将防腐剂苯甲酸和山梨酸、甜味剂糖精钠的3种标准储备液稀释100倍后进样。

2）混合系列标准溶液进样。

3）标准加入法工作溶液进样。

五、数据处理

1）从苯甲酸、山梨酸、糖精钠3种标准液进样后得到的色谱图，确定保留时间。

2）从混合系列标准溶液进样后得到的色谱图，确定苯甲酸、山梨酸、糖精钠的峰面积，作出苯甲酸、山梨酸、糖精钠的校准曲线，或拟合得线性方程。

3）从仅含样品的色谱图上，确定样品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的峰面积，在外标校准曲线或线性方程上，求得食品中防腐剂苯甲酸和山梨酸、甜味剂糖精钠的含量。

4）从标准加入法工作溶液进样后得到的色谱图，用峰面积标准加入定量方法，测得食品中防腐剂苯甲酸和山梨酸、甜味剂糖精钠的含量。

（可用Agilent HPLC 1100高效液相色谱仪的化学工作站处理上述数据，见附录。）

六、注意事项

1）实验结束后以大比例水为流动相，冲洗色谱柱，以避免柱的堵塞。然后再用有机相冲洗色谱柱，以保护色谱柱。

2）为保护色谱柱，进入高效液相色谱仪的溶液或溶剂都需用专用微孔滤膜过滤。流动相使用前，选用不同的水相和有机相滤膜在玻璃溶剂过滤器中过滤。试样进柱前，要用样品过滤头过滤，方能进样。分析结束后，须分别用纯水和有机溶剂在“Inject”状态下清洗进样口。

3）流动相需要赶气泡。仪器使用过程中，注意储液瓶中流动相使用的体积，避免瓶中流动相用完而造成泵的损毁。

4）使用定量管进样，应在“Load”状态推针，动作要平缓；进样后先切换到“Inject”状态，再拔针，避免气泡进入系统，减少柱子损毁和分离效果。

七、思考题

1.如果用校准曲线法在测得回收率大于100％时，则标准加入法所得结果比校准曲线法所得结果低还是高？针对本实验校准曲线法和标准加入法所得结果的分析，说明两种定量方法的优缺点。

2.确定检测波长的依据是什么？

八、附录

HPLC 1100高效液相色谱仪

（1）仪器的结构

高效液相色谱仪由高压输液－溶剂传输系统、样品进样－引入系统、样品分离系统、信号检测系统和数据处理系统等5个主要部分构成，其结构和流程示意如图6－18所示。

Agilent（安捷仑）公司的HPLC 1100高效液相色谱仪系统采用积木式堆积结构，整个系统的流路自上而下设计、连接，减小了系统的死体积和延迟体积，配置见图6－19所示。

图6-18　HPLC结构和流程示意图

1）高压输液－溶剂传输系统。高压输液系统不断地向系统提供连续、稳定、精确的流量，它除了主要部件高压泵之外，还包括一些辅助装置，如流动相贮液槽、脱气装置、梯度淋洗装置等。Agilent HPLC 1100系统使用真空脱气机装置，以除去流动相中溶解的气体（O₂和N₂），真空脱气机工作原理见图6－20所示。梯度淋洗装置的作用是让流动相的组成随时间而改变，以调节流动相的极性、离子强度或pH值，使试样组分的相对保留值得以改变，从而提高分离效率。

图6-19　Agilent HPLC 1100堆积配置图

对高压泵的要求是流速恒定，无脉动，流量可以调节。高压泵的输出压力一般在150～500kg·cm^－2 （137×10⁵～490×10⁵ Pa），流速在0.01～10mL·min^－1。常用的高压泵有往复泵，它通过柱塞的往复运动，由单向阀控制吸液、排液，输出液体压力和流速具有一定脉冲，一般采用双泵或多泵系统，并加阻尼装置，以提高输出压力和流速的稳定性。Agilent HPLC 1100系统使用四元泵，四元泵的工作原理如图6－21所示，它与真空脱气机组成标准配置。

2）样品进样－引入系统。将样品引入整个色谱分离系统，要求引入样品时不改变系统的流量和压力。进样系统如同气相色谱一样，通常有两种：一种是使用注射器，刺穿弹性隔膜后柱头进样；另一种是六通阀手动或自动进样，先在定量管里充满试样，如图6－22（a），然后通过切换阀进样，如图6－22（b）所示。

图6-20　真空脱气机工作原理图

图6-21　四元泵工作原理图

图6-22　手动进样时六通阀状态示意

3）样品分离系统。色谱柱是高效液相色谱仪的核心部件，整个色谱系统的关键部分，样品在这里实现分离。分析用的色谱柱长一般为10～50cm，内径为2～5mm，制备用的色谱柱内径可达25mm。色谱柱通常用不锈钢制成直形管，两端装有烧结不锈钢或多孔聚四氟乙烯过滤片。在色谱柱前通常还配有前置柱，柱内的填充物和分析柱相同，但粒度较大，其目的是除去流动相中的杂质，以避免分析柱被玷污；同时又可使流动相预先被前置柱中的固定液所饱和，以减少流动相在流过分析柱时洗脱其中的固定液，起到防止固定液流失的作用。

4）信号检测系统。对分离后的各个组分进行分离，给出响应信号。高效液相色谱仪对检测器的要求与气相色谱仪完全相同，其中主要是死体积要小、噪声要小、基线要稳、灵敏度要高。常用的检测器有：紫外光度检测器、示差检测器、荧光光度检测器、光电二极管阵列检测器。

图6-23　可变波长紫外光度检测器（VWD）光路图

Agilent HPLC 1100系统使用的可变波长紫外光度检测器（VWD），光路图如图6－23所示。可变波长紫外光度检测器的优点是：能响应190～600nm波长范围，噪音小，基线稳定；对不同物质可使用最佳波长检测，获取最大灵敏度；可根据不同需要选择不同的流动池，方便使用。

5）数据处理系统。对检测器给出的信号进行处理，给出谱图，并得到相应的定量结果。

Agilent HPLC 1100高效液相色谱仪的化学工作站及其操作系统，给分析工作带来了方便。

（2）Angilent 1100HPLC的日常开机步骤

1）开机自检。

①开启计算机电源，进入Windows 2000系统，CAG Bootp Server程序将自动运行。

②由下往上开启Angilent HPLC 1100各模块电源，等仪器自检通过，并且与计算机通讯成功（约1～2min）后，双击“Instrument 4Online”图标，进入Online工作站。

2）系统初始化。主要目的是排除色谱系统中的气泡。

①开启Purge阀。

②加大泵流量并开启泵，快速冲洗实验所用的各个通道，至无气泡从废液管中排出。（设A通道100％，2mL·min^－1，冲洗A通道至无气泡排出；再分别依次冲洗所需其余通道B、C、D等。）

③降低流量及溶剂比例至实验初始条件，并单击“OK”确认执行。

④关闭Purge阀，完成系统初始化。

3）系统平衡。主要目的是平衡、稳定色谱柱、柱温以及灯的能量。

①参数修改。选中“Method”菜单下的Edit Entire Method，在Method Information输入对此方法的描述后，单击“OK”，进入泵设置页；修改所需流量及流动相的比例后，单击“OK”，进入检测器设置页面；修改所需检测波长及参比波长后，单击“OK”，进入柱温箱设置页面；修改柱温箱温度后，单击“OK”，进入分析报告页面设置；单击“OK”，完成“Method”修改。单击“Method”菜单下Save Method As，输入存盘文件名。

②从计算机上调出实验所需方法，保持泵继续工作，以实验初始的流动相冲洗、平衡色谱柱一段时间（一般约30min）。

③在适当时间，运行“Instrument”菜单下的“System On”图标，启动系统，开启柱温箱和检测器，使柱温稳定，检测器灯的能量稳定（一般灯需要20min左右的稳定时间）。点击“System On”图标，可以同时开启柱温箱和检测器。

4）测量。

①点击“View”菜单下的“Online Signal”窗口，单击“Change”键，选择需要监测的色谱信号，并设定合适的X、Y轴范围，观测色谱基线。等基线稳定后，单击信号窗口的“Balance”，基线调零。

②基线稳定后可以进样分析。进样前，先填写Sample Information，Run Method（或手动注射进样并切换进样阀）。

③进样。在六通阀进样状态，用专用进样针在“Load”位置进样推针，扳动手动进样阀至“Inject”位置，再拔出进样针。

④图谱处理。分析样品时，可按计算机“F8”键停止“RUN”状态，选中“View”菜单下的“Data Analysis”，进入图谱分析页面，进行图谱处理。如果需要打印，点击打印机图标。

5）结束分析测量。样品分析完后，必须用相应流动相冲洗柱子15～30min（C18柱用甲醇或乙腈冲洗）。冲洗完后，流量慢慢降为0，然后选中“Instrument System Off”，退出工作站。关闭色谱仪各部件模块电源（由上往下）和CAG Bootp Server程序，最后按规定关掉电脑电源。

6）如果仅是处理图谱，那末只需开启计算机后，双击“Instrument 4Offline”图标即可。

（3）化学工作站软件处理校准曲线。

①调用数据。双击“Instrument 4Offline”图标，在Data Analysis界面下选择“File》Load Signal”，调用最低浓度标样数据文件。

②积分参数的优化。选择“Integration》Integration Events”菜单，打开积分事件表，在积分事件表中输入适当的面积拒绝值，禁止小杂峰积分，并利用积分开、关的功能，在选择需要分析的峰后，点击“Integration》Integrate”菜单，按当前积分参数条件执行积分，得到峰面积。检查是否获得所需化合物的准确峰面积，而且没有其他杂峰被积分。确认无误后，单击积分事件表左上角第一个图标，保存积分参数，并退出积分事件表窗口。

③建立新的校正表。选择“Calibration》Calibration Settings”菜单，进行校正设置，例如更改标样的浓度单位，确认工作曲线的拟合方式及保留时间窗口的参数设置，填入稀释因子。确认后选择“Calibration》New Calibration Table”菜单，确认为Automatic Setup，并填入级别（1级）和标液浓度，单击“OK”后，在屏幕下方的校正表中输入第一个浓度标样中各个化合物的名称和含量，并在校正表右侧观测各个化合物的校正曲线。

④继续进行2级校正。按步骤①调用第二个浓度标样的数据，选择“Calibration》Add Level”菜单，确认新的浓度级别为2级，并填入标液浓度，单击“OK”。依次进行下一级校正，直至校正参数编辑结束。记录标准曲线方程和线性相关系数值。

⑤报告参数的设置。选择“Report》Specify Report”菜单，选择定量方法为外标法（ESTD），确认报告的输出目的地为“Screen”，确认报告类型为“Short”，单击“OK”。

⑥保存方法。选择“File》Save As》Method”菜单，命名方法名称后保存。

⑦调用未知样品数据，打印外标法定量报告。先调用未知样品数据后，选择“Report》Print Report”菜单或者点击打印预览图标，在屏幕上生成未知样定量报告。如需打印，点击报告预览窗口右下角的“Print”键。

参考文献

［1］张玉奎，张维冰，邹汉法主编.分析化学手册（第二版）第六分册，液相色谱分析.北京：化学工业出版社，1999

［2］张晓彤，云自厚编著.液相色谱检测方法.北京：化学工业出版社，2000

［3］GB/T5009.28－1996.食品中糖精钠的测定方法.北京：中国标准出版社，1996

［4］GB/T5009.28－1996.食品中苯甲酸和山梨酸的测定方法.北京：中国标准出版社，1996

［5］强卫国.用高效液相色谱法直接测定酱油中的苯甲酸、山梨酸和糖精钠.中国卫生检验杂志，2000，10（5）：574～575

［6］Agilent公司.HPLC 1100高效液相色谱仪操作手册