凯氏定氮法

1.原理

食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。

2.试剂和材料

本方法中所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水。硫酸铜(Cu SO4· 5H2O); 硫酸钾(K2SO4)，硫酸(H2SO4，密度为1.84g/L); 硼酸(H3BO3); 甲基红指示剂(C15H15N3O2); 溴甲酚绿指示剂(C21H14Br4O5S); 亚甲基蓝指示剂(C16H18Cl N3S·3H2O); 氢氧化钠(Na OH);95%乙醇(C2H5OH); 硼酸溶液(20g/L): 称取20g硼酸，加水溶解后并稀释至1000m L; 氢氧化钠溶液(400g/L): 称取40g氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至100m L; 硫酸标准滴定溶液(0.0500mol/L)或盐酸标准滴定溶液(0.0500mol/L); 甲基红乙醇溶液(1g/L): 称取0.1g甲基红，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100m L; 亚甲基蓝乙醇溶液(1g/L): 称取0.1g亚甲基蓝，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100m L; 溴甲酚绿乙醇溶液(1g/L): 称取0.1g溴甲酚绿，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100m L; 混合指示液: 2份甲基红乙醇溶液与1份亚甲基蓝乙醇溶液临用时混合，也可用1份甲基红乙醇溶液与5份溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。

3.仪器和设备

天平: 感量为1mg; 定氮蒸馏装置。

4.分析步骤

1)试样消化

称取充分混匀的固体试样0.2～2g、半固体试样2～5g或液体试样10～25g(约相当于30～40mg氮)，精确至0.001g，移入干燥的100m L、250m L或500m L定氮瓶中，加入0.2 g硫酸铜、6g硫酸钾及20m L硫酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热0.5～1h。取下放冷，小心加入20m L水。放冷后，移入100m L容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。

2)蒸馏与吸收

按图9-1装好定氮蒸馏装置，向水蒸气发生器内装水至2/3处，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇溶液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾。

向接收瓶内加入10.0m L硼酸溶液及1～2滴混合指示液，并使冷凝管的下端插入液面下，根据试样中氮含量，准确吸取2.0～10.0m L试样处理液由小玻杯注入反应室，以10m L水洗涤小玻杯并使之流入反应室内，随后塞紧棒状玻塞。将10.0m L氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸馏10min后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。

3)滴定

以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定至终点，使用2份甲基红乙醇溶液与1份亚甲基蓝乙醇溶液指示剂，颜色由紫红色变成灰色(p H5.4); 或者使用1份甲基红乙醇溶液与5份溴甲酚绿乙醇溶液指示剂，颜色由酒红色变成绿色(p H5.1)。当蓝色的蒸馏吸收液滴定至微红色时即为终点。同时作试剂空白。

图9－1 定氮装置蒸馏图①

1—电炉; 2—水蒸气发生器(2L烧瓶); 3—螺旋夹;4—小玻杯及棒状玻塞;5—反应室;6—反应室外层; 7—橡皮管及螺旋夹; 8—冷凝管; 9—蒸馏液接收瓶。

①图片来源GB5009.5—2010，食品安全国家标准: 食品中蛋白质的测定

5.分析结果的表述

试样中蛋白质的含量按式(9-1)进行计算。

式中: X——试样中蛋白质的含量，单位为克每百克(g/100g);

V1——试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为毫升(m L);

V2——试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为毫升(m L);

V3——吸取消化液的体积，单位为毫升(m L);

c——硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度，单位为摩尔每升(mol/L);

0.0140——1.0m L硫酸［c(1/2H2SO4) =1.000mol/L］或盐酸［c(HCl) =1.000mol/L］标准滴定溶液相当的氮的质量，单位为克(g);

m——试样的质量，单位为克(g);

F——氮换算为蛋白质的系数。一般食物为6.25; 纯乳与纯乳制品为6.38; 面粉为5.70; 玉米、高粱为6.24; 花生为5.46; 大米为5.95; 大豆及其粗加工制品为5.71; 大豆蛋白制品为6.25; 肉与肉制品为6.25; 大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83; 芝麻、向日葵为5.30; 复合配方食品为6.25。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，蛋白质含量≥1g/100g时，结果保留三位有效数字; 蛋白质含量＜1g/100g时，结果保留两位有效数字。

6.精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

7.说明与注意事项

①所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制;

②消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘附在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下未消化完全而造成氮损失;

③消化过程中应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全;

④样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并不停地摇动; 或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度;

⑤当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢2～3m L后再继续加热消化;

⑥若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样5m L的比例增加硫酸用量;

⑦一般消化至透明后，继续消化30min即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色;

⑧蒸馏装置不能漏气;

⑨蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色，不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量;

⑩硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中使用;