土壤不同浓度CO2对豌豆脯氨酸含量的影响

王 蓉1，王文科，韩 枫

（1．长安大学环境科学与工程学院，陕西西安710064；

2．旱区地下水文与生态效应教育部重点实验室，陕西西安710064）

作者简介：王 蓉（1988－），女，长安大学环境科学与工程学院硕士研究生，环境科学专业。

王文科（1962－），男，长安大学环境科学与工程学院教授，水文水资源专业。

韩 枫（1979－），女，长安大学环境科学与工程学院讲师，化学工程专业。

摘 要：脯氨酸以游离状态广泛存在于植物体内，其含量在植物体受到环境胁迫时发生异常变化。以豌豆为研究对象，研究土壤在不同浓度CO2的影响下，豌豆体内脯氨酸含量的变化，进而探索土壤高浓度CO2是否可以构成豌豆生长的胁迫因子。实验结果表明随着土壤CO2浓度的升高，豌豆叶片游离脯氨酸含量呈上升趋势，且当土壤CO2浓度达到10％时，脯氨酸含量显著增加。

关键词：土壤CO2；豌豆；脯氨酸

Abstract：Proline widely presentq as free form in plants，and its content abnormally changes in response to environment stress．This paper regards peas as research object to explore whether high concentration of CO2is one of growing stress fac－tors in pea．The approach is to determine the change of proline content in pea under the influence of different concentrations of CO2in soil．Experimental results show that with the increasing of CO2concentration in soil，the proline content of free form in peas showed an upward trend，and when the soil CO2concentration reaches 10％，the proline content increased significantly． Key words：Soil CO2；Qeas；Proline

0 前言

脯氨酸作为作物蛋白质组分之一，以游离态广泛分布于作物的各个器官中（如根，茎，叶，花，果），正常条件下含量较低［1］。当植物受到一定范围的干旱、冷害、高温、盐渍等环境胁迫时，植物机体会通过增加脯氨酸的生成量来达到自我调节的目的，使植物体免于伤害，正常生长。

土壤CO2主要来源于植物根部呼吸以及有机质的氧化分解［2－3］。土壤中的CO2一部分通过土壤呼吸排放到大气，一部分与土壤发生化学反应或者扩散至地下水［4］。随着土壤CO2浓度升高，土壤中总有机碳量、阳离子交换量、砷含量相应增加［5］。当土壤中CO2浓度升高时，首先会影响土壤中的氧气含量，致使植物的正常呼吸受到影响，从而影响植物养分的制造与吸收［6］，在CO2与水的长时间共同作用下会使土壤的p H值有所降低［7］，土壤矿物质的溶解受到影响［8］。植物在土壤高浓度CO2环境下生长会出现发育不良，植株矮小等现象，甚至死亡［9－10］。然而，土壤中高浓度CO2对植物生理生化方面的影响是怎样的情况，前人对此方面的研究较少。

本文通过研究土壤在不同浓度CO2影响下，豌豆中脯氨酸含量的变化情况，进一步探讨土壤中高浓度CO2是否对植物的生长造成胁迫作用，以及在何种土壤CO2浓度下，豌豆的生长开始受到胁迫。

1 实验材料与方法

1．1 实验设计

本次实验在陕西省西安市长安大学旱区地下水文与生态效应教育部重点实验室的“地下水与环境中心试验场”进行。为了实现将不同浓度CO2均匀通入土壤耕作层，本研究构建了CO2侵入土壤模拟平台。模拟平台分为三大板块：配比混气系统，生态系统，监测系统。配比混气系统通过计算机软件控制纯CO2的输入流量与空气的输入量，将二者混合配比以达到实验所需CO2浓度，然后通过导管将配比好浓度的CO2通入试验框中。生态系统指的是试验土框，以及试验土框中种植的植物部分。试验框为木质立方体，框壁加内衬，其规格为1m×1m×0．6m。试验框底部设置PVC材质气体盘管（直径2cm），盘管上均匀排布CO2泄露小孔，共盘绕三圈，且两盘环间距为8cm，盘管上铺设1m×1m钢丝网以防止出气孔堵塞。检测系统主要是用便携式红外线CO2分析仪（GXH－3010E1型便携式红外线CO2测量仪），测量每个试验框中30cm埋深处的CO2浓度值（在试验框30cm处埋设有检测探头）。

由于实验时间为2013年9月中旬至2014年1月中旬，室外空气温度逐渐降低，为防止豌豆冻死，将实验框放置于温室中。温室温度一般保持在20～25℃。

1．2 研究材料

实验中CO2的浓度设定为对照（不通二氧化碳气体）、5％（50000×10－6）、10％（100000× 10－6）、15％（150000×10－6），每种浓度设有三个试验框作为平行试验。

试验框中所填土壤为粉质壤土，每个试验框填充大约400kg土壤，采用灌水踩踏密实方法，使各个试验框的土壤密实度大致相同。每个试验框在种植植物之前，松动30cm厚度的耕作层，并拌入2kg生物有机肥。

实验所用豌豆品种为翠珍甜豌豆，其为一年生慢性攀援草本植物，属于C3植物。在豌豆生长期内，一直通有设定浓度的CO2气体。每个实验框种植等量的豌豆50粒，在豌豆生长期内，每两天灌溉一次水，保持土壤耕作层含水率维持在8％～11％。待豌豆株高达到30cm时，再为豌豆搭架，防止其缠绕在一起从而影响生长。

1．3 测定方法

游离脯氨酸的测定选用3％磺基水杨酸浸提法［11］，实验原理为在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色物质，再用甲苯萃取后，该物质在波长520nm处有一最大吸收峰。

主要实验步骤如下：

（1）试剂准备

3％磺基水杨酸溶液，甲苯，2．5％酸性茚三酮显色液，10μg／ml脯氨酸标准溶液。

（2）仪器设备

721型分光光度计，水浴锅，漏斗，大试管（20ml），具塞刻度试管（20ml），移液枪（5ml）。

（3）制定标准曲线

取出7个具塞试管，分别编号0、1、2、3、4、5、6，首先每个试管按照编号次序（0～6）分别加入0ml、0．2ml、0．4ml、0．8ml、1．2ml、1．6ml、2．0ml脯氨酸标准溶液（10μg／ml）；然后每个试管按编号次序（0～6）再分别加入2．0ml、1．8ml、1．6ml、1．2ml、0．8ml、0．4ml、0ml蒸馏水；最后每个试管再分别加入2ml冰乙酸和3ml 2．5％酸性茚三酮显色液。混匀后，加玻璃塞在沸水浴中加热40min。待冷却后，每个试管加入5ml甲苯，充分震荡后萃取红色物质。静置，待分层后吸取甲苯层，以0号管为对照组，测试各个试管在520nm处的吸光度。测定完成后以吸光度为纵坐标，脯氨酸浓度为横坐标，做出标准曲线。

（4）样品测定

称取新鲜豌豆叶片0．5g，放入试管中并加入5ml 3％磺基水杨酸溶液，然后将试管放置于水浴锅中煮沸10min，浸提游离脯氨酸；取出试管，待冷却后，取2ml上清液，加入2ml冰乙酸和3ml显色液于沸水中加热40min，以下步骤同标准曲线制作中甲苯萃取及测定吸光度。

（5）计算结果

根据标准曲线查出所测样品对应的脯氨酸浓度，根据公式：脯氨酸含量，其中v代表脯氨酸总提取量（5ml），C代表通过标准曲线所得的样品脯氨酸浓度，α代表测定时所取体积， W指称取的叶片鲜重，n代表稀释倍数。

1．4 数据统计分析

实验数据为各浓度条件下，3组平行样的平均值，采用Excel、SPSS软件进行数据处理及显著性检验和相关性分析。

2 结果与分析

豌豆叶片游离脯氨酸测定于2013年11月中旬，为豌豆生长旺盛期。脯氨酸测定结果如图1所示：

图1 土壤不同浓度CO2下豌豆叶片脯氨酸含量对比

由图中可以看出随着土壤CO2浓度增加，豌豆叶片脯氨酸含量呈增加的趋势。且当土壤CO2浓度达到10％时豌豆叶片脯氨酸含量显著增加，随着土壤CO2浓度继续增加达到15％时，脯氨酸含量较10％处基本保持不变。

对数据用SPSS软件进行显著性差异分析，结果如表1所示：

表1 土壤不同浓度CO2情况下脯氨酸含量显著性分析

在显著性分析表中＊＊代表极显著差异，表示P＜0．01，＊代表一般显著差异，表示P＜0．05，——代表差异不明显。

3 讨论

尽管植物存在生物差异性，但是基本每种植物在各种逆境下都会积累脯氨酸［12］。植物在受到一定范围干旱胁迫时，通过诱导细胞内积累溶质，从而降低渗透势，保证细胞维持膨压状态［13－14］，而这种溶质就包括脯氨酸、甜菜碱、多胺等小分子有机物，这些物质的大量积累对植物干旱条件下吸收水分有积极作用［15］。在盐胁迫下，小麦叶片脯氨酸含量增加，且随着胁迫时间的持续，脯氨酸含量持续增加［16］。植物对于盐胁迫环境的适应分为两种，一种是调控盐离子伤害，一种是调节渗透作用，而脯氨酸在渗透调节作用中起重要作用［17］。在重金属Pb胁迫下，黄菖蒲体内脯氨酸含量也随着Pb浓度增加而增加，这也表明脯氨酸是植物适应逆境的重要渗透调节物质［18］。土壤高浓度CO2作为胁迫因子导致豌豆脯氨酸含量升高，可能也是植物通过分泌多的脯氨酸来降低水势，以此保护细胞不受损害。这可能与高浓度CO2通入土壤以后先与水发生化学反应，导致土壤酸化，并使得植物根部环境中盐离子含量升高有关。然而，是否存在随着土壤CO2浓度升高造成的胁迫程度越高，这一点还有待商榷，以不同种类玉米、小麦、钻天杨、细枝岩黄芪为材料进行干旱胁迫实验时，叶片脯氨酸积累量与胁迫程度无相关关系［19］。

4 结论

（1）在土壤耕作层通入大于10％浓度CO2时，豌豆叶片中脯氨酸含量显著增加，这可能是土壤高浓度CO2对豌豆正常生长造成了一定的胁迫作用。

（2）在豌豆中脯氨酸的这种抗逆作用并没有随着胁迫程度的增加而增强。

目前，对于高浓度CO2侵入土壤对植物生长的影响研究较少，还需要更多的实验去验证，更加深入地研究土壤CO2对植物生长的影响机制。

参考文献

［1］ 周青，黄晓华．逆境胁迫下作物积累脯氨酸的生理生态学意义［J］．农业环境保护，1991，10（6）：272－273．

［2］ Witkanp M，Frank ML．Evolution of CO2from litter，humans and subsoil of a pine．Pedobiologia，1969，9：358－365．

［3］ Fritz P，Reardon E．J，et al．The carbon isotope geochemistry of a small groundwater system in Northeastern Ontario ［J］．Water Resource．Res，1978，14：1059－1067．

［4］ Hendry M．J，Lawrence J．R，Zanyk B．N et al，Microbial production of CO2in the unsaturatal geologic media in a me－soscalemodel［J］．Water Resource，Res．1993，29：973－984．

［5］ Beaubien S E，Ciotoli G，Coombs P，et al．The impact of a naturally occurring CO2gas vent on the shallow ecosystem and soil chemistry of a Mediterranean pasture（Latera，Italy）［J］．International Journal of Greenhouse Gas Control． 2008，2：373－387．

［6］ Cotrufo MF，Rashi A，Lanini M，etal．Decomposition and nutrient dynamics of Quercuspubescens leaf litter in anatu－rally enriched CO2Mediterranean ecosystem［J］．Functional Ecology，1999，13：343－351．

［7］ Celia M A，Peters C A，Bachu S．Geologic Storage of CO2：Leakage Pathways and Environmental Risks．Spring Meeting 2002，Abstract GC 32A－03in SAO／NASA Astrophysics Data System．

［8］ Stephens J C，Hering J G．Comparative characterize ation of volcanicash soils exposed to decade－long elevated carbon dioxide concentrations at Mammoth Mountain，California［J］．Chemical Geology，2002，186：301－313．

［9］ Macek I，Pfanz H，Francetic V，et al．Root respiration response to high CO2concentrations in plants from natural CO2 springs［J］．Environmental and Experimental Botany，2005，54：90–99．

［10］Bergfeld D，Evans W C，Howle J F，et al．Carbon dioxide emissions from vegetation-kill zones around the resurgent dome of Long Valley caldera，eastern California，USA．Journal of Volcanology and Geothermal Research，2006，152：140–156．

［11］王晶英等．植物生理生化实验技术与原理［M］．哈尔滨：东北林业大学出版社，2003．

［12］邢少辰，蔡玉红．环境胁迫与植物体内脯氨酸的关系［J］．农业生态研究，1998，6（2）：31－33．

［13］柴宝峰，李洪建，王孟本．植物抗旱分子生物学研究进展［J］．山西大学学报（自然科学版），1999，22（4）：400－405．

［14］郭卫东，沈向，李嘉瑞，等．植物抗旱分子机理［J］．西北农业大学学报（自然科学版），1999，27（4）：102－108．

［15］陈秀晨，熊东金．植物抗逆性研究进展［J］．湖北农业科学，2010，49（9）：2253—2256．

［16］赵勇，马雅琴，翁跃进．盐胁迫下小麦甜菜碱和脯氨酸含量变化．植物生理与分子生物学学报，2005，31（1）：103－106．

［17］夏汉平，刘世忠，敖惠修．香根草等三种植物的抗盐性比较［J］．西北植物学报，2000，20（5）：818－825．

［18］黄苏珍．铅（Pb）胁迫对黄菖蒲叶片生理生化特性的影响［J］．安徽农业科学，2008，36（25）：10760－10762．

［19］王邦锡，等．不同植物在水分胁迫下脯氨酸的积累与抗旱的关系［J］．植物生理学报，1989，15（1）：46－51．