灭活疫苗（细胞源，－株

灭活疫苗（细胞源，－株_十年护牧：保山市动物疫病预防控制中心成立十周年论文成果集

濮永华1，龚兴建1，钏有科1，黄 杰2，周开艳1，李玉静2，杨 芳1，段 宁1

（1.保山市动物疫病预防控制中心，云南保山678000；2.施甸县动物疫病预防控制中心，保山施甸678200）

摘 要：为验证重组禽流感病毒 （H5N1亚型）灭活疫苗 （细胞源，Re－6株）对家禽的安全性和免疫效果，通过注射3个鸡群7580只，注射疫苗后连续2周观察鸡只的精神状态、采食量、粪便及鸡群死亡率，均未发生异常情况，与注射之前无明显差异。对其中2群35日龄凤翔麻鸡疫苗注射前后采血，按照 《高致病性禽流感免疫技术规范》（NYT769－2004）血凝抑制 （HI）试验操作进行HI抗体效价测定。测定结果：两群试验鸡在疫苗免疫前抗体合格率为0，第1群疫苗免疫后15天、21天、30天、45天、60天、75天，平均抗体滴度分别为1.63log2、3.78log2、5.21log2、5.39log2、5.13log2、4.5log2，免疫抗体合格率分别为18.64％、51.02％、84.21％、91.07％、88.68％、75.00％；第2群疫苗免疫后15天、30天、45天、60天、75天，平均抗体滴度分别为2.52log2、7.74log2、7.31log2、7.15log2、6.6log2，免疫抗体合格率分别为24％、100.0％、97.92％、100.0％、95.38％。结果显示：在田间试验条件下，重组禽流感病毒 （H5N1亚型）灭活疫苗 （细胞源，Re－6株）安全性高、副反应小，免疫效果较好。试验结果为推广应用最新技术生产的高致病性禽流感疫苗提供了参考。

关键词：禽流感；Re－6株；细胞源灭活疫苗；田间试验；免疫效果观察

在家禽业生产中，目前应用的禽流感疫苗主要是鸡胚源灭活疫苗，这类疫苗存在批间抗原差异大、同源疫病病原污染危险性和免疫应急大等缺点。专家认为，当前理想禽流感疫苗的要求之一是寻找新方法来代替蛋内制备禽流感疫苗的方法［1］。据相关资料介绍，利用国际最先进的细胞悬浮培养技术，生产的重组禽流感病毒 （H5N1亚型）灭活疫苗（细胞源，Re－6株），克服了鸡胚源疫苗的缺点，是我国禽流感疫苗生产的发展趋势。为了验证重组禽流感病毒 （H5N1亚型）灭活疫苗 （细胞源，Re－6株）对家禽的安全性和免疫效果，于2013年6～10月在施甸县仁和镇进行了免疫试验，结果如下。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 疫 苗

试验用疫苗为重组禽流感病毒 （H5N1亚型）灭活疫苗 （细胞源，Re－6株），由某动物疫苗有限公司提供，批准文号：兽药生字 （2013）153122206，批号：20130401，生产日期：2013年4月15日，有效期至：2014年4月14日。

1.1.2 血凝抑制 （HI）试验用抗原

禽流感 （H5N1）HI抗原，血凝效价≥7log2，批号：2013002，哈尔滨维科生物技术开发公司生产。

1.1.3 血凝抑制 （HI）试验用阴性血清

SPF鸡感染禽流感H5亚型高免血清，HI≥7log2，批号：2013001，哈尔滨维科生物技术开发公司生产。

1.1.4 试验动物

用于试验观察疫苗免疫安全性的蛋鸡群为施甸县由旺镇周正蛋鸡专业合作社60日龄蛋用雏鸡6000只，鸡群健康、生长良好；用于试验观察疫苗免疫安全性和免疫效果测定的两个鸡群为施甸县仁和镇贾爱萍育雏户的35日龄凤翔麻鸡，第1群780只、第2群800只，鸡群健康、生长良好，均为禽流感非免疫鸡群。

1.1.5 主要仪器

一次性96孔V型微量反应板、微量移液器 （配有滴头）、低速离心机、德国海道夫摇床等。

1.1.6 主要试剂

0.01摩尔／升的PBS液 （p H7.2）、阿氏液 （血球保护液）、1％红细胞悬液现用现配。

1.2 方 法

1.2.1 疫苗接种

将试验用疫苗恢复到常温后，鸡颈部皮下注射，每只0.5毫升，免疫1次。

1.2.2 采 血

第1群疫苗免疫之前当天及免疫后15天、21天、30天、45天、60天、75天各采血1次；第2群疫苗免疫之前当天及免疫后15天、30天、45天、60天、75天各采血1次。翅下静脉采血，1～2毫升／只，分离血清，冷藏或冷冻备用。

1.2.3 HI抗体效价测定

按照《高致病性禽流感免疫技术规范》（NYT769－2004）［2］血凝抑制（HI）试验操作进行，HI效价≥4log2判定为阳性，HI效价＜4log2判定为阴性，以阳性数占检测数的比例计算抗体合格率。

2 试验结果

2.1 安全性试验结果

经注射疫苗后，连续观察2周，鸡只的精神状态、采食量、粪便，以及鸡群的死亡率，按照说明注射剂量注射的3个鸡群均无异常情况发生，疫苗对肉用和蛋用雏鸡群免疫都是安全的，而且疫苗引起的副反应较小。

2.2 母源抗体测定结果

经对施甸县仁和镇贾爱萍育雏户日龄为35天的2群凤翔麻鸡采血进行抗体检测，结果禽流感抗体合格率均为0，表明两鸡群为禽流感非免疫鸡群，而且已无母源抗体。

2.3 免疫效果测定结果

免疫效果测定结果详见表1和图1、图2。

表1显示：通过对2群35日龄凤翔麻鸡疫苗注射前后采血进行抗体测定，结果表明：疫苗免疫前禽流感抗体合格率为0，第1群疫苗免疫后15天、21天、30天、45天、60天、75天，免疫抗体合格率分别为18.64％、51.02％、84.21％、91.07％、88.68％、75.00％，平均抗体滴度分别为1.63log2、3.78log2、5.21log2、5.39log2、5.13log2、4.5 log2；第2群疫苗免疫后15天、30天、45天、60天、75天，免疫抗体合格率分别为24％、100.0％、97.92％、100.0％、95.38％，平均抗体滴度分别为2.52log2、7.74log2、7.31log2、7.15log2、6.6log2。

表1 重组禽流感病毒 （H5N1亚型）灭活疫苗 （细胞源，Re－6株）免疫试验结果统计表

图1 疫苗注射后平均抗体滴度上升曲线

图1显示：两期试验疫苗免疫后抗体滴度曲线一致，免疫后15天产生抗体，分别为1.63log2、2.53log2，免疫后30天抗体滴度分别为5.21log2、7.74log2，监测到免疫后75天，抗体滴度仍分别为4.50log2、6.60log2。说明疫苗免疫后抗体滴度上升快，维持时间长，在土杂肉鸡养殖中，35日龄时使用该疫苗免疫，一次即可。

图2 疫苗注射后免疫抗体合格率上升曲线

图2显示：两期试验疫苗免疫后抗体合格率曲线一致，免疫后30天抗体合格率分别为84.21％、100％，平均为92.1％，监测到免疫后75天，抗体合格率仍分别为75％、95.38％，平均为85.19％，从免疫30天起至75天，两期试验的抗体合格率均超过农业部重大动物疫病强制免疫抗体合格率应保持在70％以上的要求。

3 小结与讨论

3.1 安全性

本次免疫试验的3个鸡群共7580只，均未出现免疫副反应，说明重组禽流感病毒（H5N1亚型）灭活疫苗 （细胞源，Re－6株）安全性高、副反应小，在基层推广具有可行性。

3.2 免疫效果

对2群35日龄禽流感H5亚型抗体为阴性鸡群免疫后进行抗体检测，结果显示：疫苗免疫后15天可检测出抗体，抗体合格率分别为18.64％、24％，平均25.32％，30天抗体合格率分别为84.21％、100％，平均92.1％，45天抗体合格率分别为91.07％、97.92％，平均94.5％，监测到免疫后75天，抗体合格率分别为75.00％、95.83％，平均仍然达85.42％。抗体合格率在免疫后30天远超过农业部重大动物疫病强制免疫抗体合格率应保持在70％以上的要求。从评价抗体滴度分析，疫苗免疫后15天两群平均2.07log2，30天两群平均6.48log2，达到最高，并已远超过判断阳性率HI效价 （4.0 log2），免疫45天两群平均抗体滴度为6.35log2，监测到免疫后75天，两群平均抗体滴度仍为5.55log2。上述结果与农业部1857号公告［3］：“接种后14日产生免疫力，鸡免疫期为6个月”的规定基本一致，在田间试验条件下、试验鸡为非SPF的情况下，免疫抗体合格率、平均抗体滴度均显示出该疫苗具有较好的免疫效果。

3.3 综合评价

根据本次免疫试验结果及分析，重组禽流感病毒 （H5N1亚型）灭活疫苗 （细胞源， Re－6株）安全性高、副反应小，免疫效果较好。

3.4 分析讨论

本次试验与同类试验免疫后21天抗体滴度达4.0log2、抗体合格率达70％的要求相比较，第1期试验免疫后21天抗体滴度3.78log2、抗体合格率50.02％，有一定差距；第2期免疫后21天没有测定。本次试验受条件限制，仅用一批疫苗两期试验鸡进行免疫效果测定，要更全面、更准确验证显示该疫苗的免疫效果，还需进行两批以上疫苗和试验鸡重复试验，并与传统鸡胚源灭活疫苗进行比较试验，将有待以后的试验得出更全面、更切合实际的结论。

参考文献

［1］沈志强，王金良，管宇，等.禽流感疫苗的研究进展与挑战及展望 ［A］.第三届中国水禽发展大会会刊 ［C］.2011：189.

［2］高致病性禽流感免疫技术规范 ［S］，中华人民共和国农业行业标准NYT769－2004.

［3］重组禽流感病毒 （H5N1亚型）灭活疫苗 （细胞源，Re－6株）质量标准 ［S］，中华人民共和国农业部第1857号公告，2012年11月.

［本文发表于 《中国家禽》（中文核心期刊）2014.14期］