藻毒素的检测

第三节　藻毒素的检测

目前，我国执行的《生活饮用水水质卫生规范》（2001年频布）和《地表水环境质量标准》（GB3838-2002）都包含了微囊藻毒素的检测项目。世界卫生组织（WHO）在其推荐的《饮用水标准指导》（第二版）中也增加了微囊藻毒素等指标（WHO，1998）。加拿大健康组织规定饮水中可接受的藻毒素标准为0.5μg/L（Guidelines for Canadian Drinking Water Quality，1993），澳大利亚学者建议1 μg/L的含量为安全饮用水的上限。

藻毒素的检测分析方法主要有生物分析法、化学分析法和生化分析法，下面就各种方法具体说明。

一、生物分析法

传统的生物分析法通常用小鼠腹腔注射或口腔灌喂评价微囊藻毒素的毒性（图4-4）。用纯化的MC或蓝藻水华粗提藻毒素进行测试，根据其生理病变及半致死量可初步确定其毒性，多数MC的LD₅₀为60~70 µg/kg。此外还有用无脊椎动物如虾、贝、水蚤及其卵进行毒性评价的研究，以细菌进行生物分析也有报道。这类方法灵敏度较差，所得到的毒型结果与小鼠的品系有关，可比性较差，且无法确定毒素的类型及结构。

图4-4 小鼠口腔灌喂或腹腔注射法评价MC的毒性

二、化学分析法

目前，对MC的化学检测常采用HPLC/UV法。一般步骤是先采用正相或反相色谱柱对毒素进行固相萃取分离，将纯化后的毒素进行紫外检测（图 4-5）。

将被测毒素与标准毒素的滞留时间（即出峰时间）进行比较，可对被测毒素的种类进行鉴定；将被测毒素与标准毒素的峰面积进行比较，可对某种毒素进行精确定量，检测限一般为ng级。目前还有用质谱与色谱串联检测藻毒素的方法，由于LC-MS/MS具有优良的选择性，对样品的纯化步骤要求不高，能够在混合物中同时实现多种藻类毒素的分离和鉴定．

图4-5 利用高效液相色谱法检测藻毒素

三、生化分析法

1. 免疫检测技术

最早的免疫检测是免疫化学技术中的一种分析方法，1960年由Yalow和Berson开创，用于检测血液中的胰岛素。从此，免疫检测广泛应用于医药化学分析领域检测激素、药品、病毒等。免疫检测的基础是抗原抗体反应，以一种抗体或多种抗体作为分析试剂，对待测物进行定性或定量分析。抗体是一种免疫球蛋白，它由动物机体对外来物质（抗原）应激反应产生，抗体可以和抗原物质形成抗原—抗体复合物。在免疫化学分析方法中，未反应的抗原和抗体被称做自由相，抗原—抗体复合物被称做结合相。抗原和抗体之间的反应具有特异性，并且非常灵敏，从而出现了免疫化学检测方法。

自20世纪80年代开始，酶联免疫吸附方法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）开始用于MC的监测。水质免疫检测中最常用的方法是竞争性非匀相酶联免疫检测，通常将抗体包被在96孔酶标板的微孔底部或其他固定相上，把酶标记在已知浓度半抗原上，以便产生可以检测的信号。在待测半抗原和已知浓度的酶标记和抗体形成复合物之后，将剩余的试剂洗脱后加入酶的底物产生显色反应。根据是否显色判别样品中是否有分析物存在，根据颜色的深浅定量抗原。

Chu等人首先提出了应用ELISA监测MC的完整步骤，他们将MC-LR与牛血清蛋白偶联，用得到的偶联物免疫兔制备兔抗MC-LR多克隆抗体（PAb），然后将MC-LR与辣根过氧化物酶偶联，以邻苯二胺（OPD）为底物，用直接竞争法做ELISA，用不同浓度的标准毒素MC-LR作标准曲线，根据底物的显色程度与标准曲线作比较即可求出毒素的含量，监测限为0.2 μg/L。他们发现抗MC-LR PAb与MC-LR，MC-RR，MC-YR有较好的交叉反应性，但与MC-LY，-LA的交叉反应性低。McDermott等用从鸡蛋黄中提取的抗MC-LR PAb做ELISA检测，发现检测限度为95 ng/L。这种方法制备的抗体产量大，方法简便，并且对MC-LR和MC-RR有良好的交叉反应性。尽管抗MC的单克隆抗体（MAb）很早就已制备，但直到1995年才由Nagata等建立起一套完整的方案，其监测限为25 ng/L。最近，他们又制备了能够特异性的识别抗MC-MAb和MC形成的免疫复合体（Immune complex）。

2. 细胞毒性检测技术

细胞毒性检测技术是利用毒素对细胞的毒性作用来检测毒素的技术，不仅可以判断毒素存在与否，而且可以对毒素进行精确的定量。

Fladmark等建立了一种根据MC导致鲑鱼或大鼠肝细胞凋亡的程度来确定MC含量的方法。他们将分离的鲑鱼或大鼠的肝细胞悬浮培养，然后加入MC，根据细胞凋亡的程度即可求出MC的含量，检测限度为10~20ng。动物细胞凋亡的第一个信号是发生凋亡的细胞与邻近的细胞分离。根据这一特性，Fladmark等还建立了用MC导致悬浮培养的鲑鱼或大鼠肝细胞解聚的程度来检测毒素的方法，所得结果比用判断细胞凋亡程度的结果灵敏5~10倍。

3. 蛋白磷酸酶抑制试验

由于MC是蛋白磷酸酶（PP1）和蛋白磷酸酸酶（PP2A）的强烈抑制剂，因此可以通过对酶活性的抑制程度来检测藻毒素。自Holmes等提出蛋白磷酸酶抑制检测（Protein phosphatase inhibition assay，PPIA）技术以来，这种技术得到了迅速发展。PPIA多数以32P标记的糖原磷酸化酶a为底物。由于糖原磷酸化酶a只能被PP1和PP2A水解，而PP1和PP2A又可被MC等抑制，因此在MC、PP和糖原磷酸化酶反应后根据PP水解糖原磷酸化酶a释放出32P的量就可计算出毒素的量。一般用不同浓度的标准毒素MC-LR作标准曲线，用MC-LR的量来代表总毒素的量。随着对硝基苯酚磷酸酯（pNPP）可被PP水解现象的发现，人们建立了一种以pNPP为底物的磷酸酶抑制比色检测技术，根据pNPP被水解后产生的有色产物的多少来确定毒素的量。PPIA的检测限度为pg级，它检测的是能抑制PP的总毒素的量，而不是某一种毒素的量。所测物质被称为MCs类物质，并以MC-LR当量作为结果，但蓝藻本身具有的内源蛋白磷酸酶活性有可能使PPIA的结果偏低。

表4-3 蓝藻毒素不同的检测方法