近二十年国际植物胚胎学与生殖生物学发展动态与前瞻

近二十年国际植物胚胎学与生殖生物学发展动态与前瞻

近二十年植物胚胎学在与相邻学科渗透、融合过程中经历了重大变化，已经形成一门综合性的新兴学科：植物生殖生物学。在这一演进过程中，包括三个进展最大的研究方向，它们对促进学科发展作了主要贡献：（1）超微结构及其他细胞生物学方法的应用，大大加深了生殖系统中细微结构及其功能的研究；（2）分子生物学研究推动了对生殖过程中基因表达的了解；（3）活细胞实验技术的提高促使实验胚胎学研究进入细胞与原生质体操作水平。今后沿上述诸方向继续深入并彼此汇合，将使生殖生物学基础研究逐步达到解决若干核心理论问题，并导致植物生殖细胞工程应用技术领域的出现。

一、当代植物胚胎学发展趋势：由胚胎学向生殖生物学演进

植物胚胎学的研究对象是植物的有性生殖过程。从19世纪20年代Amici用显微镜观察传粉受精开始，到20世纪20年代Schnarf的《被子植物胚胎学》一书问世，是植物胚胎学由植物形态学中派生为一门独立学科的时期。到20世纪50年代发展为描述胚胎学、比较胚胎学、实验胚胎学三个分支。60年代以后，植物胚胎学加速发展，这不仅表现在许多具体研究成果上，更重要的是表现在学科性质的变化上，即在20多年期间已演进为一门新兴学科——植物生殖生物学。

植物胚胎学演进为生殖生物学，是它与现代生物学中的相邻学科，尤其是细胞生物学与分子生物学融合的结果。学科的性质已超越了传统的形态学格局，成为一门交叉性、综合性学科；研究目的已经由追求“知其然”发展到追求“所以然”。1968年在巴黎召开的题为“种子植物有性生殖的细胞学”首届国际讨论会，可以被看做这一历史性转轨过程的起始标志。至1988年止，已相继召开了10次类似性质的国际会议，显示研究工作朝着新方向的深入和系统化。1988年创办了《植物有性生殖》（Sexual Plant Reproduction）国际专业性学术期刊。至此，植物生殖生物学已由胚胎学脱胎而出，成为学术界公认的新学科。

Maheshwari在50年代初曾指出胚胎学未来的趋势是实验胚胎学。实验胚胎学和生理学、遗传育种有密切的关系，能用实验方法更好地认识生殖过程的变化规律并能动地加以控制与改造，因而显示了活跃的生命力。值得注意的是，近20年来随着胚胎学在总体上向生殖生物学演进，实验胚胎学的研究方法与内容也在更新，其主要特征，一是由器官、组织的操作水平向细胞、原生质体的操作水平提高；二是实验中更紧密地结合多学科的研究。可以认为，植物实验胚胎学正在发生质的变化，向“植物实验生殖生物学”的方向演进。

学科发展是不平衡的。在新的“生长点”迅速萌发，成长为新研究领域与新学科的同时，传统学科范围内仍有许多薄弱环节与空白需要填补，而且它们在条件具备时也可能迅速发展。例如，现存植物中还有许多没有进行过胚胎学研究，尤其是在系统发育上有特殊意义的植物、珍稀濒危植物、重要经济植物的研究工作需要继续加强；比较胚胎学在积累资料的基础上有待综合提高，形成系统的理论；器官、组织水平的实验胚胎学研究亦需坚持发展并在应用上见成效。

展望90年代和21世纪初，本学科发展的内涵仍将是沿着生殖生物学的方向继续深入，其向应用方面的外延则是通过实验生殖生物学研究开拓植物生殖细胞工程新技术。以下，让我们首先回顾近20年本学科在几个主要方面的重大进展，然后再对今后的走向作一个宏观的前瞻。

二、近二十年各主攻方向的重大进展

前已述及，植物胚胎学进入生殖生物学阶段以后，具有多学科综合研究的性质。但这是就学科总体特征而言的；而在具体研究角度上仍是有一定分工的，大体上可以概括为三个主攻方向（关于比较胚胎学方面的进展不包括在内）：

（一）生殖过程中结构与功能关系的研究

这一方向是在描述胚胎学的基础上，由结构入手研究结构与功能的关系。研究手段的显著特点是由一般光镜研究发展到以超微结构研究为主，同时引入了其他各种细胞生物学方法，如荧光显微术、显微光度术、图像分析术、放射自显术等。如果说，100多年的光镜观察描绘了植物生殖过程的“粗线条”，那么，通过近20多年的研究，可以说对生殖过程中多数环节的“细线条”作了一遍扫描，揭示出不少新现象，提出了不少新概念。现择其要者简述如下：

①大、小孢子母细胞减数分裂过程的超微结构研究，打破了以往仅从染色体行为研究减数分裂的局限性，将研究范围扩大到过去无从下手的细胞质方面，揭示出这一过程中发生的细胞质改组（细胞器脱分化与再分化）现象，并且把这种现象与世代转换机制联系起来。此外，对减数分裂启动的机理也从细胞生物学和分子生物学方面进行了探讨，揭示了其细胞周期中的某些特点。

②花粉壁结构与成分的研究，特别是壁蛋白的发现，改变了花粉壁仅仅充当花粉机械性外壳的传统观点，揭示了它在保护、识别、萌发等方面的多重功能。这一研究，继之以对柱头结构与功能的研究，比较深入地阐明了花粉与柱头相互识别与作用的机理。

③围绕受精这一生殖过程的中心环节，做了大量的工作，是近20年植物胚胎学中进展最大的领域。从60年代开始的超微结构研究，涉及雌、雄配子体和配子结构、花粉萌发与花粉管生长、受精过程与合子形成等一系列主要环节，发现了许多以往光镜观察不到的现象，如：精子是有质膜与细胞器的细胞；花粉管尖端的超微结构及生长机制；助细胞的结构特点及其吸引花粉管的功能；卵细胞的不完全壁状态与精、卵细胞融合方式；雌、雄核融合的方式；卵细胞受精前后的细胞生物学变化特点；等等。进入80年代以后，研究又达到新的高度。应用连续超薄切片与计算机辅助三维重构技术和定量细胞学研究方法，发现了精子二型性（两个精子在大小、形态、细胞器等方面不同）、雄性生殖单位（两个精子与营养核联系为一个单位被运送到胚囊）、精细胞质参与受精、倾向受精（两个精子有倾向性地分别与卵和中央细胞融合）等新现象，开始触及雌、雄配子识别这样的核心问题。

④此外，关于胼胝质壁在生殖过程中的消长动态及其生物学意义，生殖系统中具有传递细胞特征的结构（绒毡层、引导组织、助细胞、中央细胞、反足细胞、胚柄、胚乳等）及其功能，花粉败育与细胞质雄性不育的机理等方面，也有相当重要的研究进展。关于生殖系统中细胞骨架的研究，是近年兴起的新热门课题，现已在花粉管中的微管与微丝和细胞质流动的关系、生殖细胞与精子中的微管分布特点等方面作了不少研究。

（二）生殖过程的分子生物学研究

生殖过程跨越植物个体发育中的三个世代，是植物一生中发育最复杂、最曲折的阶段，以往对它的研究限于形态学（胚胎学）和生理学（生殖生理）范畴，只是近一二十年才逐渐深入到分子水平，这里只举出其中几个进展较大的方面，由此可见一斑。

①花粉发育中的基因表达花粉结构简单而遗传信息丰富。据测算，花粉中约含两万多种mRNA，占种苗（孢子体）基因数的60％以上，并且多数是在配子体阶段转录的。同工酶分析表明60％～80％的表达产物在配子体与孢子体中是重复的，只有不足10％在花粉中专一表达。β－半乳糖苷酶、乙醇脱氢酶是花粉中专一表达的酶，ADP－葡萄糖焦磷酸化酶、β－葡萄苷酶、微管蛋白等在花粉与孢子体中被不同的基因编码。近年对花粉中特异基因表达的机制作了较多研究。由若干植物花粉的poly（A）RNA构建了cDNA文库和cDNA克隆，以之作为探针研究了相应的基因在不同发育时期的表达。发现一部分基因的表达时期是在减数分裂结束后至小孢子分裂前；另一部分基因表达是在小孢子分裂后至花粉成熟时。对某些专一表达的基因作了序列分析。今后的目标将重点研究基因表达在花粉发育中的功能。在拟南芥中已查明一种核雄性不育的原因是为腺嘌呤磷酸核糖基转移酶编码的基因不能表达，这是首例在分子水平上阐明一种核雄性不育的机理。

②自交不亲和基因的表达自交不亲和性是由花粉与雌蕊中的复等位基因控制的，有配子体不亲和与孢子体不亲和两类系统。近年来以花烟草为配子体不亲和系统的代表植物进行研究，证明S基因表达产物是糖蛋白。由花柱中提取的S糖蛋白在离体实验中可抑制相应S基因型的花粉管。从花柱cDNA文库中分离出为S糖蛋白编码的cD NA克隆，以之作为探针与雌蕊的不同组织进行原位杂交分析，表明S基因表达部位是在柱头、花柱引导组织、胎座表皮，而不在花柱的表皮、皮层、维管束，反映了S糖蛋白分布和花粉管生长途径的一致性。对S基因座位的结构、核苷酸与氨基酸序列也作了分析研究。在孢子体不亲和方面，以甘蓝型油菜作为代表植物，也进行了类似深入程度的系列性研究。这些分子生物学研究工作与前述从结构角度所做的研究工作汇合起来，使我们对花粉与雌蕊的识别机理有日益加深的认识。

③胚胎发育中的基因表达，据测算，种子中约有两万个基因表达，但无论在不同发育时期（幼胚、成熟胚、幼苗）还是不同组织（胚轴、子叶、胚乳）中大体不变，即多数基因的表达在胚胎发育中看不出特异性，真正胚胎专一的基因表达尚只发现极少数。对体细胞胚胎发生的研究也得出类似的结果。目前研究重点集中到少数胚胎专一基因如种子贮藏蛋白基因方面。例如，已知大豆种子中的凝集素基因在胚胎发育中的表达具有较严格的时空调节，已在烟草种子发育的特定时期与部位表达，表明这类基因表达调控机制的普遍性。迄今最大的问题是对与形态建成过程有关的基因控制尚知之甚少，这是一个难点，也是今后研究的重点。

（三）生殖过程的实验研究

实验胚胎学近20年间的发展有以下几个特点：第一，在实验方法上，由50年代以前以体内实验为主变成以体外实验为主，现在几乎生殖过程的所有环节均开展了离体培养实验。第二，通过实验研究，促进了对生殖过程诸环节发育规律的认识，如：花粉母细胞培养之于减数分裂，花药培养之于雄核发育，未传粉子房、胚珠培养之于雌核发育，花粉管培养之于花粉萌发与生长，试管受精之于不亲和性，胚胎培养之于胚胎发育，均在很大程度上补充了单纯对体内自然过程研究之不足。第三，为育种提供了许多有用的技术。除较早应用的胚胎培养外，近20多年花药培养、子房与胚珠培养、试管受精、胚乳培养、体细胞胚胎发生等技术相继在单倍体育种、远缘杂交、快速繁殖等应用领域发挥了作用。第四，实验操作手段精密化、高层次化，由器官、组织操作向细胞、原生质体操作发展，研究方法也多学科化、现代化，尤其是采用了各种活细胞观察研究方法。从80年代的下列几个重要进展来看，上述最后一个特点尤其值得我们注意：

①游离花粉培养　继花药培养之后，游离花粉培养已在烟草、油菜、玉米等获得成功。烟草小孢子培养已能自由地控制两条发育途径：在一种条件下走配子体途径，离体发育为成熟花粉、萌发花粉管并在授粉后受精结实；在另外的条件下走孢子体途径，通过胚状体再生单倍体植株。

②花粉原生质体操作　由花粉四分体分离的原生质体与体细胞原生质体融合（配子—体细胞杂交）已获得三倍体杂种植株。花粉原生质体大量分离技术开始突破，并在培养条件下诱导了多细胞团。花粉管原生质体的分离也已成功。

③精子与生殖细胞操作　精子及其前身生殖细胞的大量分离已在多种植物中成功。对分离的精子及生殖细胞开展了生活力测定与保存、二型性、超微结构、免疫学、生物化学、细胞骨架等多方面的研究，以探讨其在离体条件下的形态变化、配子识别、细胞操作等问题。例如由分离精子制备的单克隆抗体初步表明具有较专一的抗原性。初步试探了将分离精子显微注射到胚囊中的技术，初步开展了生殖细胞的离体培养与融合。

④胚囊的操作　应用酶解方法已从多种植物的胚珠中分离出裸露的生活胚囊或其成员细胞的原生质体。用显微操作技术也由几种禾本科植物中分离出胚囊及其成员细胞。利用分离的胚囊开展了某些细胞生物学研究，提出了开展胚囊离体培养与雌、雄性细胞体外融合的设想。

三、今后重点发展领域与前沿课题前瞻

由植物形态学发展到植物胚胎学经历了100多年，而由植物胚胎学发展到生殖生物学只用了20多年。现代科技的加速发展，使我们可以估计今后一二十年本学科的进展将会更快。这既表现在基础理论研究方面，又表现在应用技术方面，在21世纪均将发生重大的飞跃。

（一）基础理论研究前景

今后，植物生殖生物学基础研究将由外围深入到核心，集中解决生殖过程中一些根本性的理论问题：

①配子体世代的发育生物学与世代转换机制　世代交替是植物界特有的现象。配子体是有花植物生殖过程的主要阶段。10年前Heslop－Harrison（1979）曾呼吁植物学家重视这个“被遗忘的世代”。10年后Linskens（1988）指出：“随着时间的变迁，这一被遗忘的世代已成为许多生物学家感兴趣的中心。”估计今后的研究将会集中到以减数分裂和受精为转折点的世代转变机理、配子体世代发育的控制机理等重大理论课题上。

②双受精的机理　上世纪末发现的被子植物双受精现象是植物胚胎学史中的重大里程碑。通过大量的光镜与电镜研究，现已对这一过程的主要环节勾画出比较清楚的轮廓。以精子二型性与倾向受精的发现为契机，从现在起研究将进入新阶段，集中揭示精子分化、配子识别等奥秘。也许在双受精发现100周年之际会有一个大的突破。

③性细胞的脱分化与分化　植物细胞的全能性是在理论与应用两方面均有重要意义的问题。从60年代通过细胞培养实验证实以来，全能性的研究已有相当长的时间了。但是虽然实验工作浩如烟海，而触及全能性实现过程的两个基本环节——脱分化与再分化——的理论研究还处于外围阶段，在生殖系统细胞方面尤其如此。今后将继续围绕花粉雄核发育、胚囊雌核发育、卵细胞和其他胚胎原始细胞的激活、胚胎分化的控制等问题深入探究性细胞的脱分化与分化。

④生殖过程的系统发育　生殖过程的许多环节均反映出系统发育的特点。通过多年的被子植物与裸子植物比较胚胎学研究，积累了大量的资料，不仅有助于说明生殖系统本身的演化，而且有助于解决分类学中的某些疑难问题。今后的趋势可能是由光镜水平向超微结构与分子水平发展、由积累资料向形成系统理论发展。今后是否会由比较胚胎学发展为“比较生殖生物学”，是可以提出来研讨的问题。

（二）应用技术研究前景

正如实验胚胎学为育种实践提供了不少有用的技术一样，今后实验生殖生物学还会继续提供新的技术手段。但是值得重视的不仅是具体的技术手段，而且是从宏观上看将会导致整个新技术领域——植物生殖细胞工程的诞生。高等植物的细胞工程迄今所依赖的实验体系主要是体细胞及其原生质体；生殖系统细胞的开发利用尚很不够。这后一方面同样是很有意义的：第一，有性生殖是植物的自然属性，是体细胞繁殖不可能完全取代的；第二，生殖系统拥有各种天然的单倍细胞，有些是天然的单倍原生质体；第三，生殖系统中蕴藏着多种多样的“细胞资源”。如果这些潜力与优势能够发掘出来，人类对有性生殖的控制与利用就会上升到更高阶段。所以如果21世纪将出现性细胞工程与体细胞工程并驾齐驱的局面也许并不奇怪。从横向比较来看，动物的生殖工程（体外受精、受精卵转化、胚胎移植等）已进入实用阶段。这对于正在建立实验体系阶段的植物生殖工程也是一个榜样。通过实验生殖生物学开拓生殖工程将有广阔的应用前景。

（三）前沿课题

1.减数分裂启动机理；人工诱导减数分裂；减数分裂过程中世代转换机理。

2.花粉与胚囊的发育生物学。

3.雄性与雌性生殖单位。

4.雌、雄配子识别；倾向受精。

5.卵细胞与其他胚性原始细胞的激活。

6.胚胎分化的控制机理。

7.生殖过程的系统发育（裸子植物、被子植物）。

8.生殖系统细胞的实验操作（花粉原生质体、生殖细胞、精子、胚囊、卵细胞、合子）。

9.雌、雄配子体外融合（体外受精）；配子与体细胞融合（配子—体细胞杂交）。

10.生殖系统细胞的基因转移。

11.重要植物的前沿性胚胎学与生殖生物学研究（重要经济植物、珍稀植物、有理论研究价值的植物）。

（本文是1990年“植物科学发展趋势及发展战略学术讨论会”论文稿）