植物受精生物学研究的世纪回顾与前瞻

植物受精生物学研究的世纪回顾与前瞻

今年是发现被子植物双受精现象100周年。100年前的这个重大发现，早已在大学和中学的生物学课本中成为普及知识了。它的意义在于：双受精是植物界进化到被子植物这一最高层次所出现的独特现象，而在生物界的其他所有类群中均只有卵的受精而无中央细胞的受精；还在于双受精的第二产物胚乳对胚胎发育、种子形成与后代有重要作用，加之人类赖以生存的粮食也主要来源于胚乳。

回顾人类对植物有性生殖的认识，据史料记载从古亚述人已知椰枣人工授粉开始算起，至少有3000年的漫长历史了。但直到19世纪20年代用显微镜观察到花粉管进入胚珠，方才开始了对生殖过程的微观研究。又经过几十年，到1898年才揭示了双受精现象。从那时起，又一个世纪过去了，植物受精生物学研究又取得了哪些成就？它们是如何取得的？下世纪还将如何继续发展？我相信这些问题不仅专业工作者感兴趣，而且不少大学和中学师生也会感兴趣。

受精是亲代和子代的桥梁

高等生物大多通过受精繁殖后代，植物也不例外。植物由营养生长进入生殖阶段，在成花过程中孕育雌、雄性细胞；通过传粉，花粉管将一对精子送入胚囊中分别与卵细胞及中央细胞结合；受精卵分裂发育成胚，受精的中央细胞分裂发育为胚乳；胚乳在种子形成与萌发的不同阶段为胚提供养料，哺育着植物个体发育初期的“胎儿”。植物的一生是由受精卵这个单细胞开始的，受精是联系亲代与子代的桥梁。

受精包含三重生物学功能：第一，激发原来处于休眠状态的卵，使之进入细胞分裂状态。除极少数孤雌生殖的例外情况，卵不受精便不能分裂发育为胚。受精可说是个体发育起始程序的原动力。至于为何有此功效，正是当前研究的课题。第二，使两个单倍性的雌、雄配子合并成一个二倍性的合子。一切高等植物的正常个体均为二倍体，单倍体即使长成植物也是不育的。第三，使双亲的基因组合并到后代中。双亲基因组的一定差异导致后代一定程度的“杂合性”，这是植物赖以繁衍的遗传基础，也是人类农业生产中进行杂交育种和利用杂种优势的科学依据。

由“知其然”到“知其所以然”

人类对植物受精的认识经历了由“知其然”到“知其所以然”的逐渐深化的进程。受精是非常复杂的过程，加之参与受精的各种细胞十分微小并深藏在器官组织内部，只有依靠微观研究手段方能观察到。而只有将这个过程的来龙去脉及各种细节都弄清楚，才能以此为基础去探寻受精的机理。

大体上可以将20世纪的研究分为两半，前半世纪主要依靠石蜡切片和一般光学显微镜技术，观察描述了植物受精的“粗线条”；后半世纪主要借助超薄切片与电子显微镜技术，摸清这一过程各个环节的“细线条”。放大率与分辨率的提高，使得原来许多难以分辨的亚细胞层次的现象，特别是受精过程中细胞壁、细胞膜与细胞器的变化，成为可以观察的了。这样就澄清与修正了不少已有的结论，提出了不少新的概念，其中大多还来不及反映在当今的植物学教材中。

然而仅仅从结构的角度研究，虽然可以推测结构变化与其功能的可能关系，但还不能确证其功能。要洞察受精的机理，还必须应用多学科的手段，从不同角度去探讨和证实。例如应用各种现代显微技术（荧光显微术、显微光度测定、视频增差显微术、共焦激光扫描显微术、图像分析、显微操作等）、细胞化学、免疫学、电生理学、离体培养，以至近年日益加强的分子生物学技术，在细胞、亚细胞和分子层次上继续深入地“知其然”，同时不断探索其“所以然”。

受精是一个多阶段的、严密而有序的过程

狭义的受精指精、卵相遇与融合。但就被子植物而言，应从更广义的观点理解受精，把它看成从花粉与柱头接触直到精、卵融合这样一个连续的过程。这是由被子植物生活史的特点所决定的，因为被子植物的配子体深藏且“寄生”于孢子体组织中，而且雄配子（精子）必须通过雄配子体（花粉管）被输送到雌配子体（胚囊）中，方能与雌配子（卵细胞）融合，而以上过程完全是在孢子体内进行的。孢子植物的受精则不像这样。

广义受精包括两大阶段：作为狭义受精“前奏曲”的“配合前期”和狭义受精所指的“配合期”。每个阶段又包括若干阶段，构成一个前后衔接、丝丝入扣的链条。每一环是一个关卡，不通过“过五关斩六将”，就不能实现受精，其时空节律的天衣无缝，是在长期进化中形成的，令人叹为观止。下面我们按先后顺序对几个主要环节的研究进展作梗概的介绍。

花粉与雌蕊间的识别

花粉被传送到柱头上以后，在柱头提供的水分与营养环境中萌发，柱头是花粉的“天然培养基”。然而柱头还有另一项重要功能，即通过互相“识别”来接纳亲和花粉、排斥不亲和花粉。所谓不亲和包括两类情况：一类是防止导致物种混杂的“远缘杂交不亲和”；另一类是防止物种衰退的“自交不亲和”。在后一方面，植物和动物遵循不同的进化路线：动物主要依靠雌雄异体现象防止自体交配，而植物中雌雄异株现象较少见，主要是通过自交不亲和防止自体交配。自交不亲和又分为两种情况：一种是识别过程发生在花粉与柱头之间，识别的物质基础是花粉外壁和柱头表层分泌的特殊蛋白质分子的相互作用，好比一把钥匙专开一把锁的关系；另一种是识别发生在花粉管和花柱组织之间，据近年研究，可能和糖蛋白与核糖核酸酶有关。无论哪种情况，识别蛋白都是被称为自交不亲和基因（S基因）活动的产物。总之，柱头与花柱组成受精的第一道关卡，只让通过识别反应的亲和花粉管往下生长，以此保证物种既稳定又繁荣。

花粉管在花柱中的定向生长

亲和花粉管由柱头、花柱、子房、胚珠而入胚囊，按一定的“轨道”定向生长。各种植物的“轨道”具体结构有几种类型，此处不加详述，但条条道路总是通向受精的目的地。几十年来，对花粉管定向生长的机理进行了许多实验，提出了向化性、向触性、向电性等假说。其中实验最多的是向化性，即某些化学因素吸引花粉管生长。至于向化因素的具体性质，也提出过若干推测，后来比较集中在钙这一无机元素及信号物质上。实验根据包括：花粉培养基中不可缺少钙；花粉管在培养基上朝钙源定向生长；雌蕊的花粉管“轨道”中钙特别丰富；等等。但若将花柱切断进行实验，花粉管在其中的生长就由单向变为双向，因而近来倾向于认为花柱中的向化因素还应有其他的机制。最近有人设计了一个巧妙实验：将一些乳胶小珠置于柱头上，发现小珠以与花粉管相同的速率向花柱深处移动，由此提出新的假设，认为在花粉管尖端和花柱“轨道”组织间存在一种复杂的相互作用，涉及肌动蛋白微丝骨架、整联蛋白与细胞外基质中的糖蛋白分子及果胶质，由此推动花粉管尖端的生长。在这里，曾经一度被冷落的“向触性”理论又以新面貌重新受到重视。

花粉管如何进入胚囊

向化性虽然在花柱中未获充分证明，但在花粉管进入胚珠与胚囊的关口却有愈来愈多的研究支持。花粉管通常经由胚珠顶端的珠孔进入，在有些植物中由胚珠基部或中部进入，然后绕行到珠孔，最终仍由珠孔进入。如果说珠孔是花粉管进入胚囊的门户，那么，助细胞就是花粉管到达的目的地了。电镜观察证明，花粉管在绝大多数情况下都是穿入助细胞释放精子。胚囊中通常有两个助细胞，花粉管只进入其中一个。助细胞通常是胚囊中钙含量较高的细胞，而在一部分植物中发现，当花粉管尚未抵达胚珠时，就分泌某种信号物质（假设是赤霉素），短途传送到胚囊，诱导助细胞之一的钙含量进一步激增；过量的钙导致该助细胞退化，释放某种化学信号反过来吸引花粉管进入该退化助细胞。花粉管与助细胞间这一连串精巧的信号传递的机制目前还不十分清楚，然而确定的是助细胞对花粉管的吸引作用和钙有直接或间接的关系。

精子的释放与转移

助细胞的功能不仅在于吸引花粉管，还在于促进精子的释放与转移。在退化助细胞这个特殊的环境中，花粉管由于受到高钙或其他物理、化学因素的影响而停止生长，其尖端破裂，将包括一对精子的内含物释放到助细胞中。在花粉管内含物冲力的带动下，精子被送到助细胞的内端。此处因助细胞退化后已无细胞膜的阻拦，精子随即转移到卵细胞与中央细胞之间的位置，通常称之为受精的“靶区”。由此可见，倘若助细胞不退化，固然不能吸引花粉管进入，即使进入也不能释放精子，精子即使释放了也无法转移到受精靶区。

从助细胞到受精靶区虽然距离很短，但精子如何定向移动？和较低等的植物的游动精子不同，被子植物的精子在进化中已经失去鞭毛、没有游动能力了。关于被子植物精子是否仍保持一定程度的自主运动能力，历来有正反两派意见。近年来，根据几方面的研究结果，持否定意见者渐占优势。过去基于精子在花粉管中经常改变形态认为它有蠕动能力，并且精子中似有微丝存在，后者和细胞运动有关。近年认为精子及其前身生殖细胞内的微管骨架只负责其形态的变化，而微丝骨架的存在则未被证实。现在认为精子在花粉管中的运动是受花粉管中的肌动蛋白—肌球蛋白系统驱使的。不仅在精子周围的花粉管细胞质中有肌动蛋白与肌球蛋白包裹，更有力的证据是实验表明：由花粉管中分离出来细胞器可以沿着体外的肌动蛋白轨道运动（称为“体外重组运动”实验）。最近发现，在助细胞到达受精靶区的道路上也有肌动蛋白存在，因而有人推测精子在此处的运动可能与在花粉管中的运动服从同一机理。

“雄性生殖单位”与“雌性生殖单位”

一根花粉管中有两个精细胞，还有一个营养核。电镜观察发现以上三者往往互相联系，组成一个“雄性生殖单位”，其作用在于保证一对精子同时释放及抵达受精靶区；也可能在营养核与精子之间还有某种尚未查明的生理生化方面的相互作用。精子被释放以后，这个单位立即解散。与此对应，也可能有相应的“雌性生殖单位”存在。研究者认为后者是受精前由助细胞、卵细胞与中央细胞三者组成的一个临时结构。最明显的标志是细胞壁的变化：当胚囊尚未成熟时，以上细胞本来都具细胞壁；在胚囊成熟过程中，三者相邻部位的壁局部消失，只余下原生质膜，从而为精子（它也是无壁的）进入卵细胞与中央细胞创造了必要的条件。试想倘若此时仍有细胞壁，受精是不可能发生的。受精结束后，卵和中央细胞重新产生新壁，恢复为完整的具壁细胞。由此可见，“雄性生殖单位”和“雌性生殖单位”都是为受精作准备的一种精巧适应。

“倾向受精”与配子识别

一对精子抵达受精靶区以前，接着就进行双受精了。一个精子趋向卵细胞，另一个精子趋向中央细胞，分别与之融合。是什么原因使一对精子如此分道扬镳呢？最近在一种特殊植物材料白花丹中获得了有意义的启示。白花丹的一对精子，在大小、形态和细胞质成分上是异型的。应用连续超薄切片与计算机辅助三维重构技术，发现其中一个精子较大，具有尾状延伸物，细胞质中富含线粒体；另一个精子较小，不具有尾状物，细胞质中富含质体。在双受精时，根据细胞器的分布情况，发现富含质体的精子多与卵结合，富含线粒体的精子多与中央细胞结合。这就表明至少在白花丹两个精子和卵与中央细胞的结合是有选择性的，而不是随机的。可惜在其他植物中由于难以在细胞器上找到如此典型的精子异型性，上述被称为“倾向受精”的现象尚未获得普遍证据。人们推测，即使精子异型性不表现在结构上，也可能表现在生理生化上，通过配子间的识别而导致“倾向受精”。为此，将精子从花粉中分离出来，或进行蛋白质生化分析，或制备单克隆抗体进行免疫学分析，或构建cDNA文库进行基因分析，以求最终揭示配子识别的本质。

精子入卵与细胞质遗传

精子和卵细胞以原生质膜接触后即开始互相融合。早年的光镜观察曾认为精子“溶化”卵细胞膜而“浸入”其中。电镜观察否定了上述结论，证明是质膜的“融合”而非“溶化”，即是说，精、卵细胞融合类似原生质体融合的方式。进一步考察发现精子入卵有各种不同的情况，主要差别在于精细胞质是否融入卵细胞：多数植物的精细胞质在受精以前以不同方式被“淘汰”，因而不参与受精，它们在细胞质遗传方式上表现为单亲母系遗传；一部分植物的受精卵中有精子细胞器，证明雄性细胞质参与了受精，它们表现双亲细胞质遗传的特点；还有很少的植物，来自双亲的细胞器均存在于受精卵中，但卵细胞器在合子分裂时被“淘汰”，只有精细胞器参与后代发育，从而表现单亲父系遗传的特点。由此可见，近年通过胚胎学研究为细胞质遗传的类型提供了有力的解释。但应指出，迄今涉及的细胞器仅限于质体，只能说明质体遗传的特点；其他细胞器如线粒体的遗传还很难在细胞水平上寻找依据。

卵的激活

本文开头提到卵细胞通过受精而激活，从休眠状态转入分裂。那么，卵细胞受精前后发生的哪些变化与激活过程有关呢？多年的研究结果可以归纳如下：首先是通过雌、雄双方细胞核的融合，DNA含量增加；与此同时细胞中的RNA含量也显著增加；细胞器合成加速并转为代谢活跃状态；液泡缩小，在有些植物中原来卵细胞内的大液泡变为分散的小液泡；细胞壁再生使受精前卵细胞局部缺壁转变为具有完整的壁。以上各种变化的结果使合子进入准备分裂的状态。

受精所导致的许多变化在孤雌生殖过程中也可以看到。将向日葵未授粉的胚珠分离出来，在一定条件下离体培养，可以诱导少数胚珠中的卵细胞不经受精分裂为胚状体。电镜观察发现在这种人工诱导的孤雌生殖卵细胞中发生了类似受精卵中的超微结构变化。看来这类变化是由精子入卵或离体培养所激活的结果，而非激活本身的关键事态。

在动物受精中对激活的研究最近聚焦到钙的动态上。已经证明无论低等或高等动物，精子入卵后刺激了游离钙浓度瞬间急剧上升，形成用仪器可以记录下来的“钙波”。在低等植物墨角藻中也证明受精后钙量剧增的现象。由此认为钙信号传递系统在卵的激活中起到关键作用。在被子植物中这方面的研究一直是空白，其原因主要是过去无法操作生活的卵细胞与合子。直到最近，利用玉米上已经成功的离体受精实验系统才走出第一步。将钙离子荧光指示剂导入离体受精的卵中，通过图像定量分析发现，精子入卵后，当双方细胞质融合以后立即激发钙的瞬间剧增，经数分钟后复又下降。由此看来，钙信号系统在受精中的作用可能在生物界中具有普遍意义。

卵的激活机理固然还存在许多谜团，而中央细胞的激活更是未解之谜。卵细胞还能偶尔进行孤雌生殖，中央细胞则更难自主发育，说明后者对受精的依赖性更大。而如果没有胚乳的发育，即使孤雌生殖产生了胚也难以存活。因此破解中央细胞激活之谜也是今后值得探索的课题。只有这样，我们对双受精的本质才有深刻的认识。

受精的离体实验研究

写到这里，我们已开始由植物受精的体内研究转入离体研究。在植物发育生物学中，离体实验是一项有力的手段，它具有多方面的优点：①可以在摆脱整体制约的条件下突出被研究的局部对象（如器官、组织、细胞）；②可以人工设置比自然状况下更为稳定的实验条件，以便有针对性地研究各种单一因素对发育的作用；③可以有效地应用各种技术，较直接地施加于所研究的发育环节。离体实验不仅可以补充对体内自然进程的研究之不足，而且还可以促使发育朝所希望的方向变化。早在20世纪50年代，实验胚胎学便作为植物胚胎学中一个活跃的分支学科奠定了基础。经半世纪的努力，几乎在植物有性生殖的所有环节上均开展了卓有成效的离体研究，其中不少已成为植物生物技术的重要手段，如花药培养、子房培养、胚胎培养、胚乳培养等，离体受精也是其中之一。

从离体授粉到离体受精

离体受精的初级阶段是60年代成功的“试管受精”，现改称离体授粉，即将胚珠或子房分离出来置于培养基上进行授粉，然后通过胚珠或子房培养完成离体条件下的受精和胚胎发育，在试管中形成种子与出苗。试管受精实验当时是受两方面实验成果的启发而开展的：一是“子房内授粉”；二是胚珠（或子房）培养，当时，为了排除柱头与花柱对不亲和授粉的障碍，科学家试验将花粉悬浮液直接注射到罂粟子房内，结果花粉可在子房内萌发，花粉管进入胚珠受精导致种子形成。用此方法曾取得了若干远缘杂交组合的成功。但罂粟具有可供注射的较大子房，而其他植物并不一定具有这样的可行性。于是人们设想干脆对胚珠或子房进行离体授粉。离体授粉的胚珠或子房能在培养基上发育，则是来源于当时已成功的受精后胚珠与子房培养实验。这两方面的思想和技术前提综合起来，试管受精便应运而生了。

然而离体授粉条件下的受精与胚胎发育仍然是在胚珠或子房内进行的，还不是真正意义的离体受精。像动物体外受精那样的真正的离体受精在被子植物中的实现，直到90年代方才成功。其间经过较长时间的艰辛跋涉。

实现真正的离体受精需要三项技术前提：一是需要将精子从花粉中、卵细胞从胚珠中分离出来，并保持生活原生质体状态；二是需要挑选单对的精、卵原生质体进行融合；三是需要将为数很少的精、卵融合产物进行离体培养。经过整个80年代的研究，以上三项技术已经成熟，从而为离体受精奠定了基础。这一突破性的实验首先在玉米中取得成功。

玉米的离体受精与植株再生

花粉在外界渗透压骤降时会破裂，利用这一原理，采用渗透压冲击法促使玉米花粉破裂释放出精子，再经一定步骤去掉杂质获得纯净的精子。用短时间酶解的方法使胚珠软化，再以细针手工解剖出玉米卵细胞原生质体，在特制的微电融合仪中使之融合，融合后的产物称为“人工合子”或“离体合子”。将人工合子转移到特制的微室中，每一微室中置入一至数个人工合子。由于数目稀少，人工合子不能单独培养，必须依赖其他正在旺盛生长的细胞的“饲养”才能发育。在这里，饲养细胞取代了胚乳的作用。为此，将微室置入盛有饲养细胞的小培养皿中，人工合子通过微室底部的滤膜吸取外周培养皿中饲养细胞提供的活性成分而开始分裂，经若干时日后形成多细胞团，以后进一步分化成胚状体，最后再生小植株。小植株移栽到土壤中以后长成正常开花结实的植株。如果用于融合的精子和卵细胞分别来自不同的品种，则再生植株表现出品种间杂种的遗传特征，这证明用离体受精的方法可以实现正常的有性杂交。

植物离体受精具有多方面的意义：①借助这一实验系统，可以直接研究受精过程的生活动态，这是以往研究体内受精所不能做到的；②可以摆脱“配合前期”的各个关口直接操作配子配合，从而有可能克服不亲和性等自然障碍，实现远缘交配、诱导孤雌生殖，或将外源基因直接导入人工合子进行遗传转化；③人工合子培养再生植株使植物个体发育的最初阶段——胚胎发生——以及整个植物生活周期完全在受控的离体条件下进行；④利用分离的卵细胞、合子和幼胚，可以建立受精前后和胚胎发生不同时期的cDNA文库，进而研究这些发育阶段的基因表达。事实上，短短几年中，以上这些设想均在付诸实施，并且出现了许多可喜的苗头。

面向21世纪的植物受精的实验研究

在玉米离体受精这一模式系统建成之后，围绕上述各方面的设想，各种实验研究正在齐头并进：

除玉米外，正在研究其他植物的离体受精。小麦精、卵融合已培养出多细胞团。玉米卵细胞与其他一些禾本科植物精子的融合产物也已分裂成细胞团。除人工合子培养外，自然合子培养也已成功，在大麦与小麦中再生了植株，在烟草中发育成细胞团。未受精卵的培养也取得了阶段性成果，在玉米中达到细胞团，在烟草中启动了第一次分裂。烟草未受精中央细胞的培养，也已分裂为细胞团。以上各种培养，虽然有些迄今还只达到多细胞阶段，但随着今后技术的进步，再生植株终究指日可待。那样，下世纪将会建成许多适应不同要求的离体实验系统，迎来人工控制植物受精的新局面。

借助玉米离体受精实验系统研究了受精过程的若干细胞生物学问题。例如，得出了离体受精的精确时间表：1s内完成精、卵融合；20min内完成合子细胞壁再生；35～60min完成融合；40～60h完成合子第一次分裂等。前文所述精子入卵后诱发钙的剧增，也是依靠此系统得以揭示的。

借助分离的卵细胞与人工合子构建了cDNA文库。由于可以收集的细胞数目有限，在实验中只利用了128个卵细胞和104个人工合子，通过逆转录酶—聚合酶链式反应（RT－PCR）方法构建文库，再通过差异筛选从中分离出若干在卵或合子中特异表达的基因。虽然目前还不能证明这些基因在受精过程中的功能，但总算迈出了艰难的第一步，为今后在分子水平上解析受精和胚胎发生早期的功能基因及利用转基因技术改造这一过程开辟了道路。卵的激活是启动胚胎发生与个体发育的起始程序，而掌握了决定这个起始程序的基因，便找到了控制植物个体发育起点的入门钥匙。

可以预期，下世纪植物受精生物学研究的特点，将是应用各种先进的实验手段，结合体内和离体的研究，在分子与细胞水平上深入洞察受精的机理，并控制个体发育中这一重要过程的发育方向。我们有信心展望一个“受精工程”或“生殖工程”应用于植物改良的时代的到来。

（原载《世界科技研究与发展》，1998年第20卷第3期）