胚珠组织的实验操作

胚珠组织的实验操作

1984年9月24～28日在英国伦敦大学召开了一次题为“胚珠组织的实验操作——显微操作、组织培养与生理学”的国际学术讨论会，与会各国学者约50人，我国周光宇教授也应邀出席并作了报告。会后编辑出版了文集《胚珠组织的实验操作》（The Experimental Manipulation of Ovule Tissues，ed.by G.P.Chapman，S.H.Mantell and R.W.Daniels，Longman，New York，London，1985）。这大概是迄今国际上以胚珠为主要研究对象的第一次学术会议和第一本文集。

正如该书“序言”中所指出的：自从60年代花药培养取得突破以来，20年间花粉的实验操作占据了植物实验形态学家和育种家的主要精力。但近来有将兴趣转到雌性部分——胚珠的趋势。胚珠对于各种授粉处理、离体培养或其他刺激的反应，是理论与实际上均有重要意义的课题。胚珠的实验操作作为一个正在冒尖的技术研究领域，开始被提上日程。这次会议的召开和文集的出版，就是适应形势发展的需要，检阅现有的进展并激励今后的探索。

Chapman的《细胞核事态与被子植物雌配子体：研究前景》一文，可说是该书的引论。文中根据各方面的研究资料提出了不少富于启迪的见解：在雌配子体中，发育的全能性处于抑制状态，通常需要通过受精作用方能解除这种抑制。但抑制的解除和全能性的恢复表现并非一定依赖配子配合不可，因为在未传粉子房或胚珠培养、远缘花粉授粉、辐射花粉授粉等实验条件下，即使没有精卵融合，亦可诱导胚胎发生。由此看来，粉管受精（sypho nogamy）、配子配合和胚胎发生这三个在一般自然条件下依次发生、紧密相连的过程，在实验条件下是可以分割而互相脱钩的。甚至通常作为雄配子的精子，在实验中也可以转变为仅仅充当携带外源DNA的载体。基于这种认识，对作为外源DNA受体的胚珠的实验操作，也应该用新的眼光来看待。

该文集共收入19篇论文，归为5部分：①胚珠组织复合体；②显微操作；③未传粉胚珠的发育；④传粉胚珠的发育；⑤配子配合的改变。为了更集中地反映这些方面的研究动态，本文将书中内容分以下三个部分加以简介：

1.未传粉胚珠的操作

未传粉子房与胚珠的培养作为诱导单倍体植株的手段，在法、中两国已经做了不少成功的研究，过去鲜为人知，最近逐渐引起其他各国学者的注意。这一趋势在文集中也有所反映。Chapman的综述中有几处引述了这方面的资料，特别是介绍了我国研究者的工作。文集中直接涉及这一课题的报告只有两篇。一篇是Hosemans与Bossoutrot关于由雄性可育与不育甜菜的未受精胚珠培养出单倍体的效果高于花药培养和种间授粉的报告。Ahloowalia试验小麦的未传粉子房培养，从获得愈伤组织的情况推测，来源于体细胞的可能性较大。他认为子房培养诱导单倍体的技术目前尚不成熟，主要困难一为诱导频率低，二为来源可疑。看来对于这一技术的评价，目前仍是见仁见智。关于胚囊及其组成成分的人工分离，只有一篇报告。Allington用显微操作器由小麦、大麦、小黑麦的新鲜胚珠中分离出卵器、助细胞、极核、反足细胞核、分裂中的胚乳核以及受精后含胚乳与原胚的完整胚囊。在适宜的缓冲液中分离的成分很少损伤。还有人提出离体培养花粉生殖细胞或反足细胞的设想（Wilms与Keijzer）。另一方面，Beasley与Jensen总结了他们利用未受精胚珠培养研究激素对棉花受精和种子纤维发生的作用：在培养基中加入GA，模拟了花粉管诱导一个助细胞退化的作用。GA促使两个极核发生部分的融合；IAA则促使极核完全融合并分裂为二倍体“胚乳”。未受精的胚珠需要GA和/或IAA才能产生棉纤维；受精的胚珠则无需外源激素即可产生棉纤维。

2.传粉胚珠的操作

这部分的工作在文集中占有主要地位。Wilms与Kei jzer研究菠菜花粉管定向生长的机制，发现与花柱组织自上而下的渗透压梯度有关。离体实验也证明，当培养基浓度逐渐降低时，花粉管继续生长；当花粉管生长停顿时，可以通过提高培养基湿度重新启动其生长。上述作者在菠菜胚囊的电镜照片中，还观察到两个精子的细胞核处于统一的细胞质中的现象，称为“双核精细胞”（其实Na vashin早在1912年即已发现类似现象，当时称为“双核生殖细胞”——杨注）。他们设想，如果这对精子在受精过程中始终是联动的，则与卵或极核融合后就可能分别产生三倍体胚或四倍体胚乳。关于外源DNA引入胚珠的报道，是新近的热门话题，在文集中有好几篇论文涉及这一问题。引入DNA的技术路线大致有两条：一是利用花粉管作为载体将DNA带进胚囊；二是将DNA直接注入胚囊。Hepler等用显微注射器将外源DNA注入蚕豆等的培养花粉管中的生殖核，注射后的花粉管可维持生长，但用其进行授粉则尚有困难。另一方面，他们还将外源基因注入Salpiglosis sinuata离体培养的子房，随后予以授粉，试图通过花粉管将注入子房腔中的外源基因带进胚囊。子房在培养条件下已经结子并已出苗，他们现正在做外源基因整合与表达的测定。Steinbiss等论证了以胚珠为受体系统施行DNA注射的优点，并提出在大麦上将DNA注射和胚珠培养结合起来的技术流程。De Wet等在引述了近年有关文献资料后指出：高等植物的卵细胞具有可被转化的特点——卵细胞能摄入外源DNA，并将其片段并入本身的基因组。花粉管是将外源DNA带入卵细胞的有效载体。现已发现，花粉管刚萌发时，管尖有一区域是缺乏细胞壁的；在钙的参与下，外源DNA可由此处被摄入花粉管。作者报告了他们的试验：玉米自交系花粉在含有异系玉米DNA或Tripsacum DNA的培养基中萌发后，用以授粉，实现了外源基因的转移。Hess是最早从事花粉转移基因的研究者，他和合作者以《用花粉作为媒介实现高等植物的基因转移》为题，总结了自己多年的工作。作者指出，花粉在自然条件下即有充当外源基因（如病毒）载体的功能，而人工复现这一自然过程的实验完全获得成功。他们的基本方法是将花粉培养在含有各种外源遗传物质的条件下，用这种花粉授粉，然后从表型、形式遗传学、酶学、分子遗传学等角度对所得到的后代进行分析。迄今，在烟草中实现了致瘤DNA的转移；在矮牵牛中实现了花青素基因、大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因和转移酶基因的转移。周光宇报道了她多年从事胚珠遗传操作的实验结果，特别是棉花方面的实验。授粉后，将外源DNA注入子房中的胎座部位，合子可被转化，后代表现出包括经济性状（如抗枯萎病性）等方面的变异；某些变异株系已稳定遗传5～7代。这一报告表明中国的胚珠遗传操作研究已经跻身于国际行列。

3.受精后胚珠的操作

这方面的报告比较分散。Monnier与Lagriffol所研究的是一个老问题，但采用了严密的方法。他们以荠菜这一研究胚胎发育的经典材料，比较了胚培养、胚珠培养和活体内的胚胎发育动态，通过精细的测量，证明就胚胎发育的优劣而言，其顺序为：活体内＞带胎座的胚珠培养＞胚珠培养＞胚培养；其中带胎座的胚珠培养效果接近活体内的发育。Inomata长期从事芸苔属的受精后子房培养，这次他报道了应用一种改良培养基成功地获得许多种间杂交组合的杂种。Ferdinando等从生化特征的角度研究油棕的胚胎发育。X射线微区分析表明胚和胚乳在若干元素含量上的差别：胚乳所含诸元素中，以Cl、K、Ca含量最高；胚中缺乏Cl、Ca，但P的含量超过胚乳。免疫识别技术查明油棕胚中含有胚性特异蛋白质（embryo specific pro teins）。有趣的是，根据这一特点可以区别组织培养中的体细胞胚与愈伤组织。Litz从事芒果等热带果木的胚珠培养或珠心组织培养。这类植物多有由不定胚形成多胚现象的特性，因此通过胚珠或珠心培养，比较容易再生植株。Tarawali则对另一问题发生兴趣。一些豆科植物的子叶细胞含多线染色体。他将一种豌豆属植物的子叶培养后，采用分离技术，获得大量的具多线染色体的细胞核。这可能成为高等植物体中继菜豆胚柄细胞之后又一研究多线染色体的良好系统。

胚珠的实验操作并非自今日始。早在20世纪50年代，Maheshwari学派即开展了以胚珠为对象的实验胚胎学研究。虽然他们最初设想的由胚珠培养诱导单倍体的设想遭到挫折，但结果却引出了受精后的胚珠与子房培养、离体授粉等重要成果。60年代花药培养的巨大成就吸引了全世界的注意。胚珠的实验研究一度处于低潮。70年代未传粉子房与胚珠培养取得突破。与此同时，现代遗传工程技术开始应用于胚珠受体系统。这些令人瞩目的进展，使人们重新认识了胚珠操作的价值。这样才有这次学术讨论会的召开和文集的问世。我想，今后10年内这个领域的发展可能进入一个更加迅速的时期。面对这一趋势，我国的植物胚胎学、遗传学、育种学和遗传工程等学科的工作者，当会找到自己的用武之地。

（原载《武汉植物学研究》，1987第5卷第1期）