日本植物实验生殖生物学与细胞工程研究颇具特色

日本植物实验生殖生物学与细胞工程研究颇具特色

根据国家教委与日本学术振兴会的学术交流计划，我于1990年11月16日至12月5日访问了日本若干有代表性的植物生殖生物学与细胞工程研究单位，走马观花地了解了本领域内的一些研究近况和趋向。现将此行所收集到的信息略作介绍。

植物实验生殖生物学

植物实验生殖生物学主要用离体操作技术研究与控制植物生殖过程，它与植物细胞工程有密切的联系。日本这方面的研究有较长的历史，例如早年Y.Iwanami教授关于花粉生理学，M.Ito教授关于减数分裂机理等研究，在国际上享有盛誉。这次访问的I.Tanaka副教授（横滨市立大学生物系），原是Ito的博士研究生，多年从事麝香百合花粉发育的研究，成就卓著。80年代以来，从事小孢子培养研究，实现了有控制的离体发育，即在正常培养基中发育为成熟花粉并产生花粉管；在含5－溴脱氧尿苷（BUdR）的培养基中分裂为多细胞团。近年他又由百合中分离出花粉原生质体；由花粉原生质体中分离出生殖细胞和生殖细胞的原生质体。目前的研究包括：①花粉原生质体和生殖细胞的融合。通过电融合与培养，发现两个花粉原生质体融合后，其中来自双方的两个生殖细胞均能分裂，形成两对精子；两个生殖细胞融合后形成异核体，但生殖核不融合也不分裂；一个花粉原生质体和一个生殖细胞融合后，前者所含生殖细胞分裂成一对精子，后者则不分裂。这些实验，为花粉原生质体和生殖细胞的操作提供了有意义的资料。②生殖细胞的细胞骨架研究。用免疫荧光技术观察体内的花粉生殖细胞有平行的微管束，而分离的生殖细胞中只有均匀的荧光，认为这是由于在分离过程中微管蛋白发生了解聚所致。还用rhodamine－phalloidin观察到生殖细胞中有肌动蛋白微丝存在，这和当前国际上多数学者的研究结果不一致。③生殖细胞形成过程中细胞器的变化。观察到和其他研究者所发现的相似现象，即在生殖细胞形成过程中，原来小孢子中的细胞器的DNA消失。百合生殖细胞中没有质体，只有线粒体，但用DAPI荧光染色看不到线粒体中有DNA。在藻类、苔藓、蕨类的某些植物中，精子形成时也有类似现象。④正在着手进行花粉发育过程中基因表达的研究。在这项研究中，分离的生殖细胞和精子是一个很有用的实验体系。

H.Miki－Hirosige教授（横须贺市，神奈川牙医学院生物学研究室）在植物生殖生物学方面工作时间较长。80年代以来，她和S.Nakamura博士合作，应用超微细胞化学和放射自显影等手段，对麝香百合的减数分裂过程中细胞板形成、花粉壁形成和生殖细胞壁动态、柱头与花柱分泌物等问题的研究很有特色。近年，她们从超微结构角度研究了花粉原生质体、生殖细胞的特征。

M.Kyo在筑波大学H.Harada教授指导下攻读博士学位期间，在烟草花粉培养和发育途径的控制方面有独特的成就；当培养基中含谷氨酰胺时，花粉继续体内的配子体发育形成成熟花粉并萌发花粉管；当在不含谷氨酰胺的培养基中经过一段饥饿处理再转到含谷氨酰胺的条件下，就能启动胚胎发生分裂再生单倍体植株。最近，他用分子生物学方法发现，在上述两种培养条件下，花粉产生不同的磷蛋白。根据当前一般观点，某些蛋白质的磷酸化对于细胞接受外界刺激和表达其功能有重要作用。循此追溯，也许能找到控制花粉两条发育途径的关键所在。

植物细胞工程

Harada教授领导的筑波大学生物科学研究所及附设的基因实验中心，是日本从事植物分子生物学及遗传工程研究的主要单位之一，在体细胞胚胎发生、器官发生、转化、次生代谢产物等方面都有深入的研究。现重点介绍其体细胞胚胎发生的研究进展。一般诱导体细胞胚胎发生的方法，是先将植物组织培养在含外源生长素的培养基中，然后转移到无生长素的条件下，但这种通用的诱导程序很难将生长素对胚胎发生的专一效应和其他伴生效应（如对细胞伸长、分裂、不定根产生、木质部发生等）区分开来加以研究。H.Kamada近年的研究发现，胡萝卜组织可以无需生长素诱导，而通过各种胁迫处理诱导胚胎发生。有效的胁迫因素包括高渗透压、氯化钠、次氯酸盐、重金属离子（镉、钴、镍、锌）等，从而开辟了一条排除外源生长素干扰，探讨体细胞胚胎发生机理的途径。这种方法的另一优点是比2，4－D诱导的体细胞胚成苗率高、苗的发育正常，用于制作人工种子质量较好。Satoh等发现：胡萝卜细胞培养中体细胞胚的发生与两种糖蛋白有关。在形成体细胞胚时，细胞释放GP65；当形成愈伤组织时则释放GP57。免疫细胞化学定位表明，GP57存在于植物多种组织的表层，如胚和胚乳之间，根的表皮、内皮与周皮，叶与花瓣的表皮等。推测可能与愈伤机制有关。目前已由GP57获得cDNA。通过反义RNA表达实验（anti－sense RNA expression），表明可以抑制GP57的产生。这一实验系统可望用于通过基因工程方法诱导体细胞胚胎发生。

附属于三菱公司的植物工学研究所是设备较新的植物生物技术研究所，在原生质体培养、细胞杂交、基因工程三方面均有显著的研究成果。主持人是Y.Yahiro和K. Shimamato。研究对象主要是水稻和油菜：①原生质体培养。J.Kyozuka等近年建立了一套高效的水稻原生质体培养技术。借助哺育培养，3～4天原生质体开始分裂；7～10天形成多细胞团；2～3周形成肉眼可见的小愈伤组织；转到固体培养基上经3～8周再生小植株，再生频率达15％～50％。多个供试品种用此方法均获成功。由于培养过程中发生体细胞无性系变异，因此在试验中通过原生质体培养选育出新品种（称为“原生质体育种”），并从推广品种中选出一个矮秆、多穗、迟熟新品种“初梦”。②细胞杂交。Hayshi等实现了栽培稻和其野生近缘种的细胞杂交，目的是企图将后者的C₄光合作用、抗病、抗虫、耐盐等特性转入栽培品种。细胞杂种的选择方法是：用碘乙酰胺（iodoacetamide，IOA）处理栽培稻原生质体，抑制其分裂；野生种原生质体本身不分裂；只有杂种细胞通过核质互补作用能够分裂。已经由栽培稻与4种野生稻的组合中得到250个杂种植株；由栽培稻与稗草的组合中得到40根苗。应用原生质体融合技术转移细胞质雄性不育也在水稻和油菜中获得成功。Kyozuka等采用的方法是：用IOA处理抑制可育品系原生质体细胞分裂；用X射线处理杀死不育品系原生质体的细胞核，由此筛选出胞质杂种具有前者的核基因组和后者的雄性不育细胞质。T.Sa kai和J.Imamura用类似方法将萝卜的细胞质雄性不育特性转移到油菜中。不同的是，在油菜中用X射线杀核的效果不佳，因此采用由萝卜原生质体制备胞质体，然后和用IOA处理过的油菜原生质体融合。③基因工程。采用电激法将抗病基因导入原生质体，获得了抗CMV的转基因烟草植株并育成抗性品系。最近，在该研究所工作的中国留学人员朱亚峰作出一项突出的成就，通过转基因技术育成了抗缟叶枯病（即白叶枯病）的水稻品种，开创了在粮食作物中通过基因工程育成抗病品种的新局面，在日本被新闻媒介广泛报道。Imamura博士正在从事的一项新课题是企图将有毒害作用的基因导入植物以诱导雄性不育。为此，需要将毒害基因连接在具有组织专一性的启动子上，使其专一地在花粉中表达毒害作用而不致危及其他组织。目前，已做了可行性试验，即将GUS基因、抗卡那霉素基因、具有组织专一性的启动子三者连接起来，导入烟草原生质体。由此筛选出转基因植株，在花粉发育过程中GUS基因的表达呈1∶1分离，表明上述设想是可行的。下一步将用毒害基因直接进行试验。

日本烟草公司下属植物开发研究所除从事烟草研究外，还广泛研究各种蔬菜、花卉的组织培养与细胞工程，其特色偏于应用方面。所采用的技术有花药培养、未受精胚珠培养、试管受精、原生质体融合、突变体筛选、遗传转化等方法。其中，小白菜的花药与花粉培养在高温（35℃）、高蔗糖条件下诱导了小孢子均等分裂，通过胚状体途径再生单倍体植株。烟草未受精胚珠培养通过一段饥饿培养后诱导了雌核发育愈伤组织并再生单倍体植株。甜瓜的未受精胚珠培养也获成功。试管受精技术用于烟草、辣椒的种间杂交和烟草×Salpiglosis、冬瓜×Langenaria的属间杂交，获得了杂种。该研究所将所研究的各项技术用于育种，广泛开展杂交育种、单倍体育种、杂种优势利用、无病毒植株生产、快速繁殖、水耕栽培等工作，不少产品在商品生产中获得经济效益。

（原载《国际学术动态》，1991年第4期）