植物有性生殖研究的前沿

植物有性生殖研究的前沿

由国际植物有性生殖研究协会（IASPRR）举办的第13届国际植物有性生殖会议（13th International Congress on Sexual Plant Reproduction），于1994年7月10～14日在奥地利首都维也纳召开。本届会议的地方组委会主席由维也纳大学的Heberle－Bors与Hesse两位教授担任。会议接受论文摘要154篇，收入《植物有性生殖研究前沿》（Frontiers in Sexual Plant Reproduction Research）论文摘要集。我国有2人出席，另有我国留学人员2人、我国香港地区1人。会上选出了下届主席Cresti教授，并决定下届会议于1996年在澳大利亚墨尔本召开。在闭幕式上，Lin skens教授向荣获本届会议优秀青年发言奖的我国留学人员李一勤博士和荣获优秀墙报奖的Keijzer博士分别授予了奖章。

会议包括五项议程：①植物有性生殖研究前沿；②雌性发育；③雄性发育；④受精与早期胚胎发生；⑤生物技术。还安排了花粉胚胎发生、雄配子与受精两次专题讨论。现将主要内容简介如下。

1.植物生殖系统中结构与功能的关系

当前植物生殖生物学研究趋势在结构研究的基础上更多地侧重于结构与功能关系的探讨。

在雄性生殖系统方面，有关细胞骨架和钙离子在花粉发育、萌发与花粉管生长中的作用，仍占显著位置。在花粉中，相继发现若干细胞骨架成分的存在，如一些植物的花粉中存在类似驱动蛋白（kinesin）的多肽成分（Cai et al.），烟草花粉中含有类似动力蛋白（dynein）的蛋白质（Moscatelli et al.）。烟草花粉成熟过程中积累大量的肌动蛋白抑制蛋白（profilin），为体细胞中的50～100倍（Mittermann et al.）。Van Aken等对花粉管中微管骨架的功能提出新的看法。他们用25～400μ m秋水仙碱处理Nicotiana sylvestris花粉管，导致微管解聚、花粉管细胞质丧失正常极性，但这并不妨碍花粉管生长；处理解除后，微管骨架与细胞质极性复原。他们推测，微管的重建是以花粉管质膜和胞外基质为模板的。另一方面，生殖细胞的微管较能忍耐秋水仙素，然而一旦解聚则较难复原。这表明生殖细胞和营养细胞中的微管骨架具有一定的差异。

Gó rska－Brylass等用细胞化学方法研究了生殖细胞形成过程中钙的变化。小孢子分裂后产生生殖细胞之初，后者周围积累钙，并与酸性磷酸酶的分布一致。生殖细胞脱离花粉壁成为球形时，其细胞质与核质中出现钙；当生殖细胞成熟为纺锤形时，钙水平进一步提高，并和ATP酶相关。在营养细胞中则未见钙的分布，这表明钙与生殖细胞的分化有特别密切的关系。Tupy等应用几种作用不同的抑制剂（如抑制细胞内钙离子通道的TMB－S，抑制胞外钙离子通道的verapamil，抑制钙调素的W－7，抑制肌醇磷酸酶的氯化锂等），研究了花粉萌发中钙和依赖钙的蛋白磷酸化的作用。Molo等用几种方法诱导Agapantus花粉管钙离子含量增加，结果导致花粉管生长取向的改变，而钙离子通道抑制剂则可阻碍上述变化，表明花粉管质膜的钙离子通道对于花粉管生长取向有重要作用。除了钙与钙离子通道外，讨论中还涉及其他离子流与花粉萌发及花粉管生长的关系。Feijo等应用一种精密的振簧探针（vibra ting probe）研究了麝香百合花粉管中电流与离子流的时空模式，认为在花粉萌发过程中，花粉粒是电流的发生源，而花粉管则是电流的流失槽；电流经由花粉管表面的离子通道而不断流失。Obermeyer与Bentrup应用膜片钳（patch clamp）技术发现麝香百合花粉萌发时有3种钾离子通道类型，并认为钾离子通道和花粉启动萌发的机制有关。

关于花粉管生长的模式，最近发现有些植物花粉管尖端的延伸生长不是匀速的，而是脉冲式的。Willemse等在研究脂麻掌和麝香百合花粉管离体授粉系统时观察到，花粉管尖端每隔一定时间向后产生环形的管壁增厚，在增厚区临时聚集新合成的壁物质，随后该区即猛然向前延伸。无独有偶，李一勤等也注意到烟草花粉管生长的脉冲式运动。她们侧重从结构成分角度对此进行研究，发现花粉管前端管壁上的间断的环形结构上有阿拉伯半乳聚糖蛋白质与果胶质的抗原决定簇共同定位，从而推测前者可能成为与果胶质结合的蛋白质而在花粉管壁的脉冲式生长过程中起作用。

在会上涉及花粉结构与功能的细胞生物学研究还有花粉变态反应原（Rodriquez－Garcia et al.，Fernandez et al.）、rRNA（Majewska－Sawka et al.）、花粉壁（Southworth and Jernstedt，Hubrich et al.）、花粉鞘（Ruiter et al.）、绒毡层（Hesse et al.，Rowley et al.，Clé ment and Audran）等方面。

关于雌性系统和受精过程中结构与功能的研究，在本届会议上的信息相对分散，如大孢子发生与胚囊发育过程中微管骨架的变化（徐是雄与叶秀麟，Bednara et al.）、胚囊发育与卵细胞的超微结构（Imre and Kristó f，Salaj et al.）、珠孔的超微结构（Engell）、用冬青油透明法观察玉米受精动态（Mó l et al.）等方面均有一些研究。Mar tinez－Pallé和Herrero以阿月浑子（Pistacia vera）为材料，对很少被研究的合点受精现象作了细致的观察。该植物子房中仅含一粒胚珠，传粉前，胚珠与子房壁之间有一较阔的空隙；传粉后，在花柱中有大量花粉管生长，但仅一根花粉管进入子房。此时，胚珠合点端的珠柄组织产生一种称为小桥（ponticulus）的突起，向子房壁延伸，成为花粉管到达胚珠的通道。花粉管由此进入胚珠合点端，再绕道珠孔端进入胚囊。此后，小桥部分木质化，使胚珠重新和子房壁隔离，防止其他花粉管进入，这种结构上的变化是对合点受精的一种有趣的适应。Chaubal和Reger研究了珍珠谷助细胞与受精的关系。当胚囊成熟时，该植物胚囊中的两个助细胞均退化，此时助细胞中有大量钙离子的流入，超量的钙积累于液泡中，并导致助细胞退化。以后，随着丝状器附近质膜的瓦解，钙又向外分泌，扩散到珠孔区。Russell和黄炳权研究了烟草与白花丹两种植物胚囊中的细胞骨架及其与受精的可能关系。在烟草中，当花粉管进入一个助细胞释放精子时，该助细胞中的肌动蛋白增加，形成两个冠状结构，分别介入助细胞和卵细胞与中央细胞之间。在白花丹中，没有助细胞，但在卵细胞和中央细胞之间也形成一个由肌动蛋白构成的冠状结构。作者推测该结构可能是将精细胞输送到受精靶区的轨道。

2.植物生殖发育过程中的基因表达

植物生殖发育过程中的分子生物学研究在本届会议上占有显著的分量。其中，花粉发育过程中的基因表达及其调控是热门话题。研究目的主要是从花粉的众多基因（绝大多数是非特异性的）中分离出特异表达的基因，揭示其与形态发生的关系。研究手段主要是cDNA克隆、特异基因筛选与鉴定，并应用转基因技术查明特异基因在转基因植株中的表达效果。如我国留学人员许慧琳与Singh等人合作，由白菜型油菜分离出在绒毡层和花粉中特异表达的Bcp 1基因，将其反义拷贝导入拟南芥中，结果转基因植株的绒毡层中该基因表达受阻，从而导致花粉不育。又如，Narasllah应用“遗传腐蚀”（Genetic ablation）方法，将毒素基因与花粉特异启动子连接后，导入拟南芥和油菜中，使转基因植株的花粉中毒死亡。以上两种方法被认为有可能直接应用于雄性不育和杂种优势之中。Mas carenhas等人着重研究花粉发育和热激蛋白的关系。雄配子体中是否存在大量热激蛋白至今仍属未知。为此，将各种类型的大豆热激蛋白基因与花粉特异启动子连接后，导入拟南芥中，得到了在花粉中表达各类热激基因的转基因植物。此外，将大量热激基因导入紫露草属的成熟花粉，后者经热激处理后能表达热激反应。他推测，花粉之所以一般缺乏热激反应，并非由于缺乏热激转录因子，而是由于其他尚未查明的原因。Twell利用转基因作为剖析花粉发育早期与晚期特异基因表达的工具，这些转基因构件中含有各类特异启动子。例如将营养细胞特异启动子与报告基因结合，以研究营养细胞与生殖细胞的分化问题。结果表明，小孢子的非对称有丝分裂是两者分化的决定因素。当人工诱导小孢子对称分裂时，两个子细胞中均有特异表达，而不限于像正常情况下只有在营养细胞中表达。当将营养细胞特异启动子与毒素基因连接后导入转基因植物，营养细胞中毒死亡。有关雄性发育过程中基因表达的研究还有：在烟草中分离出小孢子特异基因NTM 19（Olden hof et al.）、花粉特异基因NTP 303（Waterings et al.）、P34cdcz（Hrzenjak et al.），将矮牵牛中控制chalcone－fla vanone同分异构酶的基因转入烟草中表达（Dang et al.），水稻花药特异基因的分析（许慧琳等），高粱与珍珠谷花粉发育中的基因表达（Frova et al.），玉米中控制雄花与花粉发育的突变体（Peterson）等。

雌性器官与细胞发育过程中的基因控制，过去研究较少，这次会上反映出有加强的趋势。Mariani关于烟草雌蕊发育与花粉—雌蕊相互作用的研究发现烟草雌蕊中存在某些特异基因，其表达随花粉管的生长进程而在雌蕊的相应部位依次加强。此外，用柱头特异启动子与雌蕊—花粉变态反应原基因连接进行转化，所产生的转基因植株具有不育的柱头。Tunen等人研究矮牵牛成花过程中的MADS同源异型盒（homeotic box）基因，发现了一系列fbp基因控制着性器官的形成，应用转基因技术获得了各种具畸态花器官的转基因植株，如花瓣变为萼片、雄蕊变为雌蕊、胚珠变为其他器官等。作者在此基础上提出了控制雌性器官形成的ABCD四组同源异型盒基因模型，它们分别决定花序形成、花形成、心皮形成、胚囊形成4个环节。Modrusan等人发现拟南芥的一个同源异型盒包括一系列隐性突变体，表现为不同形式的胚珠异常，如缺乏外珠被、外珠被变为心皮状结构、胚囊畸态等，对各种突变体进行了cDNA克隆与序列分析。Ylstra等人研究了黄酮醇（flavonol）在雌蕊组织中的分布及其对花粉管生长的作用。将GUS基因与黄酮醇合成有关的启动子连接，通过转基因，在柱头、花柱、胚珠中证实了黄酮醇的存在，应用反义cDNA获得了抑制雌蕊中黄酮醇合成的转基因植株，花粉管在后者的雌蕊中不能正常生长，从而不育。

3.植物性细胞的操作

植物性细胞的操作，除集中反映在以“生物技术”为题的会议程序中以外，也散见于其他方面。其内容可概括为两个主要问题，即花粉培养与花粉转化，性细胞原生质体的操作与体外受精。

会议东道主Heberle－Bors在其“花粉生物技术”报告中，介绍了他们实验室在烟草花粉离体培养两条发育途径中开展遗传转化的研究进展。烟草幼嫩花粉在不同培养条件下分别进行配子体发育（离体成熟→活体授粉）与孢子体发育（胚胎发生→再生植株）。在配子体发育途径中，单核小孢子经基因枪导入抗卡那霉素基因后，培养为成熟花粉，后者授粉获得17 000粒种子，其中5粒种子萌发为抗卡那霉素的幼苗，有3株幼苗被Southern blot检测证明为转化植株。用二核中期的花粉进行类似实验没有得到转化植株，作者推测这是由于此时外源DNA难以整合到生殖细胞的基因组中。因此选择适当的花粉发育时期对转化效果有重要意义。在孢子体发育途径的转化实践中，用基因枪将GUS基因导入胚胎发生花粉，培养5天后，在10⁴粒花粉中有5粒呈蓝色反应，最终获得2株稳定表达的转化单倍体。Jardinaud等人应用电激法进行玉米花粉转化试验，根据GUS瞬时表达检测，有高达0.1％的花粉转化率。在这一实验中，用硝酸钾与硫酸镁抑制花粉核酸酶活性以防外源DNA降解、选择最佳电激条件、GUS基因与适当启动子的连接等，是转化的重要因素。

花粉脱分化需要一定的胁迫诱导，如烟草需要饥饿胁迫，油菜需要热激胁迫。有人推测，这两种胁迫可能具有共同的分子基础，即诱导热激基因活化。Zarsky等人由烟草中分离出具有热激基因性质的Nthsp 18 p cDNA。当花粉经受饥饿处理时，Nthsp 18 p RNA剧增并启动胚胎发生分裂，直至心形与鱼雷形胚时期方才消失。Van Lammeren及Cordewener等人分别研究了甘蓝型油菜花粉胚胎发生中热激蛋白的作用，发现在32℃高温处理下，热激蛋白HSP 70在细胞内的分布发生变化，同时伴随微管排列与细胞核位置的变化，结果导致小孢子对称分裂与胚胎发生。在玉米中，当用7℃低温诱导雄核发育时，同样存在HSP 70的表达（Vergne et al.）。

关于性细胞原生质体的操作，涉及花粉原生质体和配子原生质体的分离、融合、培养及细胞、分子生物学研究。周嫦等人报告由几种芸苔属植物的新鲜及超低温保藏的花粉中分离出原生质体，将青菜的幼嫩花粉原生质体与甘蓝型油菜的下胚轴原生质体融合后，培养出3个杂种小植株。Tanaka等人作了麝香百合花粉原生质体的转化试验，结果表明：在花粉粒、四分体原生质体、近成熟花粉原生质体、生殖细胞原生质体4种受体系统中，仅花粉原生质体转化成功。比较了几种启动子与GUS基因连接后进行转化的效果，其中花粉特异启动子pzm 13的转化效果最好；电激法与基因枪相比，前者效果为好。Ueda与Tanaka由麝香百合花粉中分离出原生质体，再由后者分离出生殖细胞与精细胞的核。电泳分析发现生殖核与精核中含有特异的碱性蛋白p 22.5和p18.5。免疫细胞化学鉴定表明，这两种蛋白的抗体仅和生殖核与精核反应，不和体细胞核与营养核反应，它们是雄配子所特有的组蛋白。

有几项关于雌性细胞分离与培养的工作。杨弘远等人介绍了用酶解—渗透压冲击方法分离较大量的烟草胚囊与雌性细胞原生质体。Kovac等人用2，4－D处理小麦柱头促使胚囊膨大，然后用显微解剖法分离胚囊与卵细胞，分离率可达20％，Kristó f等人用酶法分离出蓝猪耳（Tore nia fournieri）不同发育时期的胚囊与雌性细胞原生质体。不同时期的分离效果不同，最佳分离时期是开花前2～3天。Thijssen等人采用不同的酶组合分离出矮牵牛各个发育时期的胚囊，还试探了胚囊的微滴培养，但未获成功。Dumas等人进行玉米的受精后胚囊培养（实际上带有部分珠心组织），由合子至二细胞原胚时期的胚囊培养出再生植株。

雌、雄配子体外融合（体外受精）的新进展得到高度注意。Kranz等人在用微电融合法诱导玉米精卵体外融合并再生植株以后，目前又用高钙、高pH法诱导融合成功，其融合体已发育成多细胞团。Dumas等人则在1～10mM CaCl₂条件下诱导玉米精细胞与卵细胞及中央细胞融合，还在会上用显微录像显示了融合过程，并谓第一个精子进入卵细胞后阻碍其他精子的进入。Barnabás等人用微电融合法诱导小麦精卵体外融合，并培养成细胞团。杨弘远等人报告了用PEG法诱导烟草卵细胞与其他各类雌性、雄性及体细胞原生质体之间的单对融合成功。Mathys－Rochon等人用显微注射法将玉米精细胞分别注入分离胚囊的卵细胞与中央细胞，据称从初步迹象推测可能发生了雌、雄核的融合。

利用分离的卵细胞及合子开展分子生物学与细胞生物学研究已经提上日程。Kranz等人应用RT/PCR技术从玉米的128个卵细胞和104个人工合子建立了cDNA文库，以分离卵细胞与合子的特异基因，现已从融合后18～19小时的人工合子中分离出首批克隆。还试探了将外源DNA注入卵细胞的技术。Mogensen与Holm利用分离的大麦卵细胞与合子研究受精过程的细胞核动态，并进行了DNA的荧光光度测定。

4.结语

虽然本届会议不能一览无余地反映当前植物有性生殖研究的所有方面，但我们可以从中看出有性生殖研究前沿的几个鲜明特色。总的看来，生殖生物学研究仍然是沿着前述结构与功能、分子生物学、实验操作三个重点方向发展，三者之间又互相交叉。

第一，在结构与功能关系的研究中更着眼于功能的揭示。单纯的结构描述主要是针对某些特殊的材料或特殊的现象，更多的工作则是将结构（以超微结构为主）研究和细胞化学、免疫学、分子生物学以至生物物理学等研究手段结合起来，通过研究方法的综合与精密化，以求深入揭示生殖过程中特定结构与特定功能的关系。

第二，继20世纪60～70年代以来细胞生物学被引入胚胎学研究之后，80年代末至90年代开始的分子生物学的引入，是对植物生殖生物学的又一次巨大的推动。cD NA克隆、特异启动子的应用和转基因技术已成为研究生殖发育不同阶段特异基因功能的有力手段。研究范围逐渐由性器官发育推向性细胞发育，由雄性发育推向雌性发育，由胚胎发育推向受精与合子发育。发育生物学和生殖生物学的界限变得日益模糊。

第三，实验胚胎学研究已由以往器官、组织水平的操作迈向细胞、原生质体水平的操作。性细胞及其原生质体的分离、培养、融合、转化，在高新生物技术与基础生物学研究方面的双重意义日益突出。90年代开始成功的玉米精卵体外融合，一方面带动了在更多的植物材料和更广泛的融合组合中的研究进展；另一方面也开始作为研究配子融合与识别机理、性细胞基因表达、遗传转化等的实验体系。花粉培养与花粉转化取得了显著成就，花粉原生质体操作方兴未艾。植物生殖工程（性细胞工程）的前景日益明朗化。

植物有性生殖研究的突飞猛进，给我国研究者带来了新的挑战与机遇，值得我们认真思考以及采取相应的对策。

（原载《国际学术动态》，1994年第6期。作者：杨弘远、周嫦）

【注释】

[1]即本书前一篇文章《植物生殖的细胞生物学：一个新的学科生长点》。