重组体的鉴定与分析

第四节　重组体的鉴定与分析

运用DNA体外重组技术把外源基因导入到受体细胞中的目的是为了得到我们所需要的含有目的基因的阳性重组体，因而重组体的筛选是DNA体外重组技术中的一个至关重要的环节。由于在DNA体外重组实验中，外源DNA片段与载体DNA的连接反应物一般不经分离直接用于转化。由于重组率和转化率不可能达到100%的理想极限，因此必须使用各种筛选与鉴定手段区分转化子（含有载体或重组体的转化细胞）和非转化子（不含载体或重组体的非转化细胞）、重组子（含有重组DNA分子的转化子）和非重组子（仅含有空载体的转化子），并且将含有序列正确的目的基因的转化子与不含有目的基因或目的基因的插入方向或序列不正确的非期望重组子区分开来。不同的载体及宿主系统，重组体的筛选方法不尽相同，其基本思路大同小异，基本步骤：首先筛选出转化菌；然后筛选出带有重组体的克隆；最后是对DNA重组体进行鉴定（图3－12）。

图3－12　插入失活法筛选pBR322阳性重组子

一、筛选出转化菌

所有的克隆载体上均带有可供选择的遗传学标志或特征，可以利用这种标志或特征筛选出转化菌。比如质粒都含有针对某种抗生素的抗性基因，转化后将细菌在含有这种抗生素的培养基中培养，未被转化的细菌即被杀死，能生长的细菌就是已转化的细菌。

二、筛选出带有重组体的克隆

借助遗传学表型可以对重组体进行直接筛选。DNA体外重组所用的载体常常携带有一个或几个可供选择的遗传标记或标记基因，外源基因插入载体并导入受体细胞后，受体细胞可获得或缺失这些标记的表型，从而筛选出我们所需要的阳性克隆。

1.插入失活法　DNA体外重组使用的载体，常带有两个以上可供筛选的遗传标记，当外源基因插入其中一个标记基因时，此标记基因不再表达，因此可供鉴别。例如PBR 322质粒载体含有氨苄西林（Ap）和四环素（Tc）抗性基因，当外源基因未插入前，能在含Ap和Tc的琼脂平板上生长（表型为Ap^rTc^r），当插入外源基因失活Tc后（插入外源基因使Tc基因的原阅读框架发生改变而失活），阳性重组体只能在含Ap而不含Tc的琼脂平板上生长（表型为Ap^rTc^s），从而和自身环化的空载体形成的克隆区分开来（图3－12）。又如：pUC质粒、PGEM质粒及M13噬菌体系列等携带有一部分lacZ基因，编码β^－半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的α－肽，这些载体导入合适的宿主细胞后，可表达α－肽，从而与宿主细胞（不表达α－肽）之间形成α－互补，在含显色底物X－gal的平板上形成蓝色菌落或噬菌斑。当外源基因插入失活lacZ基因后，则不能表达α－肽，阳性重组体形成无色菌落或噬菌斑。

2.插入表达法　有些载体在筛选标记基因前含有一段负调控序列，当外源基因插入失活该负调控序列时，其下游的筛选标记基因才表达。如pTR262质粒的四环素抗性（Tc^r）基因上游存在cI基因的负调控序列，可以抑制Tc^r基因的表达。当外源基因插入失活cI基因时，Tc^r基因可获得表达，阳性重组体能在含Tc的琼脂平板上生长，而阴性则不能（图3－13）。

图3－13　pTR262介导的抗药性正选择

引自张惠展.基因工程概论.上海：华东理工大学出版社，1999

3.遗传互补法　某些重组体在宿主细胞中表达后，其表达产物可以互补宿主细胞中的营养代谢缺陷。根据这一特点，可筛选重组体。例如外源基因导入哺乳动物细胞后的阳性克隆筛选常用这种方法。真核载体上带有标记基因，如二氢叶酸还原酶基因、胸腺核苷激酶基因等。二氢叶酸还原酶（dhfr）在真核细胞的核苷酸合成中起重要作用，dhfr^－表型的真核细胞（如CHO细胞突变株）由于不能合成四氢叶酸，培养基中如不含胸腺嘧啶细胞就会死亡。但将含目的基因及dhfr基因的载体转入dhfr细胞后，细胞则能合成四氢叶酸，核苷酸合成也能顺利进行。因而转入dhfr基因的细胞就能在无胸腺嘧啶的培养基中存活，而未转入dhfr基因的细胞则死亡，从而筛选得到阳性克隆。重组子的筛选还需要第二个选择标记，并通过插入灭活的方法进行第二轮筛选。

4.噬菌斑形成筛选法　噬菌体载体系列包装外源DNA后的重组分子的长度是其野生型长度的75%～105%时，即能形成有活性的噬菌体颗粒，在培养平板上出现清晰的噬菌斑，而不含外源DNA的单一载体DNA因其长度太小不能被包装成活的噬菌体颗粒，感染细菌后不形成噬菌斑，从而达到初步筛选的目的。

上面这些方法常是筛选阳性重组体的第一步，是根据遗传表型对重组体进行初步筛选，其结果并不一定十分可靠。因为所筛选出的菌落的抗药性未必都来自载体分子上的抗药性标记基因，相当多的受体菌基因组中存在着一些广谱抗药性基因，它们通常为抗生素诱导表达，而且受体细胞药物抗性的回复突变也是可能的。另外，营养缺陷的筛选过程同样存在着受体细胞的回复突变问题。因此，为了进一步鉴定我们所获得的重组体是否是含有目的基因的克隆，还需要用以下一种或几种方法进行检测。

三、对重组体进行鉴定

1.根据质粒大小与酶切图谱鉴定　用常规方法提取重组体DNA后，如果插入载体的外源DNA片段较大，可直接进行琼脂糖凝胶电泳，比较待鉴定重组体与载体DNA的迁移率，若重组体迁移率小于载体，则为阳性克隆，反之则为阴性克隆。如果通过上述途径不能明确区分迁移率大小，则可对重组体DNA进行酶切鉴定，选择目的基因两端的酶切位点来酶切，能被切出含有外源DNA片段的则为阳性，而空载体是不能被切出含有外源DNA的片段的。对于可能存在外源基因双向插入载体的重组子，选择适当的限制性酶切位点，还可以通过酶切鉴定插入方向。比如可以选择载体上的一个酶切位点，和目的基因内的一个不在片断中点的酶切位点进行双酶切，酶切产物再进行琼脂糖凝胶电泳，如果目的基因插入方向相反，则电泳时两条片断的大小就会有变化。

2.核酸探针检测法　包括菌落（噬菌斑）原位杂交、Southern印迹及Northern印迹，每一种方法都要有针对目的DNA的特异探针，它大多是以放射性核素、地高辛、生物素、化学发光素等标记的DNA。

（1）菌落（噬菌斑）原位杂交：基本程序是：重组DNA分子转化（转染）细菌后，将其涂布在固体培养基表面，形成菌落或噬菌斑后，用一张与培养皿面积相当的硝酸纤维素膜或尼龙膜与培养基表面轻轻接触一下使菌落或噬菌斑中的少量菌体或噬菌体吸附于膜上。当转化子数较少时，也可用牙签直接点到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，培养一段时间，待菌落（噬菌斑）长到一定大小后，与标记的DNA或RNA探针进行杂交。根据阳性反应的位置，可从保留的母板上挑出所需的克隆。

（2）Southern印迹：由Southern于1975年发明，并以其名字命名的用于检测目的DNA片段的技术。基本程序是：提取重组子DNA或基因组DNA，用适当的限制性内切酶消化后，DNA片段用凝胶电泳依大小分开，转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。然后膜上的DNA片段与标记的DNA或RNA探针进行杂交。凡是含有与探针互补序列的DNA片段经放射自显影或显色底物处理后，就会在X线片上出现杂交带或在膜上发生颜色反应。

（3）Northern印迹：这是用于检测宿主细胞是否表达目的mRNA及表达量多少的技术。基本程序是：提取细胞RNA，用凝胶电泳分离后，转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上，与标记的DNA探针杂交，其余步骤同Southern印迹。

3.聚合酶链反应（PCR）　可根据外源基因两侧的序列即载体的序列设计上、下游引物，或直接利用目的基因上的5′端和3′端序列设计引物。提取重组子DNA后，以其为模板进行PCR扩增，或直接用细胞进行PCR扩增，阳性重组子应能扩增出外源基因片段。反之则否。对于那些用PCR或RT－PCR方法获取的目的基因的重组体的鉴定，PCR法更为方便。另外，设计合适的PCR引物，还可以鉴定目的基因的插入方向。比如，一个引物与目的片断的一端互补，另一个引物与靠近目的基因另一端的载体序列互补，则只有插入方向正确的重组体才能得到PCR产物。该法只适用于鉴定有限长度的外源DNA，通常在3kb以下，因为超出此范围后很难用常规PCR进行扩增。

4.DNA序列测定　DNA序列测定是验证插入载体中的外源基因是否正确的最确凿证据。尤其对由PCR扩增得到的目的基因尤为必要。PCR扩增DNA由于受酶、引物浓度、离子强度、退火温度等因素的影响，会产生一些自发突变。因此，为检查PCR扩增产物的忠实性，需对其进行DNA序列测定。如果重组体中目的基因要用来表达目的蛋白，则进行序列测定是非常必要的。目前常用的方法是双脱氧末端终止法。