第一节技术简史对于核酸的研究已有多年的历史

第一节　PCR技术简史

对于核酸的研究已有100多年的历史，20世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术。H.Ghobind Khorana和他的同事于1971年最早提出了核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。但是，由于当时技术条件的限制，基因测序、引物合成等方面的研究都存在一定的局限性，特别是还没有发现稳定的耐热DNA聚合酶（thermostable DNA polymerase）等诸多因素，这个设想在当时看来不大可能实现，并且很快被人遗忘。

1985年，美国PE－Cetus公司人类遗传研究室的Kary Mullis和他的同事利用大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段成功地在体外扩增了哺乳动物基因，从而实现了Khorana的设想，发明了具有划时代意义的PCR。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适的条件——模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。

Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加，给PCR技术操作程序添了不少困难；②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。因此，PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。

1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。

1988年，Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2小时后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2小时后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2小时后其残留活性是原来的40%；②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶；③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度（2.0kb）。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏度也大大提高。为与大肠埃希菌聚合酶ⅠKlenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA聚合酶（Taq DNA Polymerase，Taq pol）。此酶的发现使PCR广泛地被应用。