液体培养基配制基本步骤

大肠杆菌_分子生物学实验指

第一节　大肠杆菌

大肠杆菌是一种杆状细菌。其染色体呈环状，约4.6×10⁶个碱基对，含有4288个基因。它能在基本培养基中快速生长。这种培养基仅含如葡萄糖这类碳水化合物及盐，前者作为碳元素及能量来源，后者提供氮、磷和微量金属元素。如果加入了氨基酸、核苷前体、维生素以及菌体必需的其他物质即在所谓丰富培养基内培养，大肠杆菌会长得更快。本节的目的在于提供培养细菌基本而又必要的知识。

当大肠杆菌在液体培养基中生长时，首先将小部分细菌接种到盛有灭菌培养基的容器中。在细菌开始分裂前的这段时间叫延迟期。在丰富培养基中，典型的菌株每20～30min完成一次分裂。细菌在这段时期呈指数生长，亦称对数生长期，有时更进一步细分为对数早期、对数中期、对数晚期，细菌密度逐渐增加到一定程度。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，细胞停止迅速分裂，达到饱和状态。

一、培养基的制备和细菌学工具

(一)极限培养基

按以下配方配制5×基本培养基。

在一个2L的烧瓶中，将配方中各成分加入水中，加热搅拌直至其溶解，加水定容至1L，用KOH调pH值至7.0。然后倒入玻璃瓶中，拧松盖子，于15lbf/in^2[1](相当于1.034×105Pa)高压灭菌15min，待培养基冷至50℃以下(在这个温度时，手持瓶子可感觉热，但能握得住)，再加入其他补充成分和抗生素，然后盖紧盖子，并可于室温无限期保存。临用前用无菌水将高浓度培养基稀释成1×培养基，并且每升加入以下无菌溶液:

如果需要还可加入以下溶液:

(二)丰富培养基

配方如下:但高压灭菌需25min，不需稀释。

以上培养基均加水至900mL并高压灭菌，然后再加入共100mL灭菌的0.17mol/L KH₂PO₄和0.72mol/L K₂HPO₄

以上培养基均加水定容至1L并高压灭菌25min。

(三)固体培养基

按下述方法配制基本(极限)培养基平板和完全(丰富)培养基平板，配制前准备好无菌带盖的9mm的培养皿。

1.基本培养基平板

800mL水加入15g琼脂，高压灭菌15min，待冷却至50℃，加入200mL无菌的5×基本培养液和碳源，按需要加入补充成分和抗生素。于超净台上每平板倒入25～30mL培养基，每升培养基可制作大约35～40个平板。

2.完全培养基

将水加入以下所列出的培养基配方的成分中，定容至1L，高压灭菌25min。每个LB和H培养基平板倒入25～30mL培养基，每个肉汤培养基平板倒入45mL培养基。

培养基灭菌后，室温冷却至60℃，迅速加到平板(抗生素在60^oC左右加入，半乳糖苷可在灭菌后加入)。待平板凝固后，将平板包裹好贮于4℃。

(四)上层琼脂培养基

上层琼脂培养基常用于将噬菌体或细胞在平板的表面均匀分成一薄层，做平板斑实验用。

以上4种上层琼脂培养基分别加水定容至1L，混匀。

(五)穿刺琼脂培养基

穿刺琼脂培养基用来保存菌株。据认为半胱氨酸可延长细菌在穿刺培养物中的存活时间，加入胸腺嘧啶则可使thy^－细菌生长。

(六)细菌接种时常用的实验工具

图1-1　涂布棒的制作

1.接种环

(1)灭菌，将接种环置于酒精灯火焰中灼烧直至变红。

(2)冷却，将接种环触及无菌琼脂平板的表面直至其不发出咝咝声。

2.无菌牙签

圆形木制牙签或扁平牙签尖端有时被用来挑取单个细菌，或噬菌斑。

(1)将牙签装在锡箔纸盖着的烧杯或原装盒中高压灭菌。

(2)牙签经重新高压灭菌后可以重复使用。

3.涂布棒

(1)加热并弯曲一支直径4mm的玻璃管或巴斯德吸管制备涂布棒(如图1-1)。

(2)灭菌，将涂布棒的三角部分浸没于95%酒精中，从容器中取出后再通过灯焰，点燃其上的乙醇。

(3)等涂布棒上的火焰熄灭后，将其触碰无菌琼脂平板的表面使其冷却。

4.酒精灯。

5.超净工作台。

二、在液体培养基中培养

(一)过夜培养

1.取5mL液体培养基加至一支无菌的直径16mm或18mm的培养试管中。

2.用接种环，挑一个单菌落，浸没于培养液中并轻轻振动接种环，使待接种的细菌分散在培养液中。

3.盖好试管，在摇床或转鼓式培养装置上于37℃、60r/min的速度培养至饱和状态。新鲜培养至饱和期约需6h，此时培养液细菌浓度大约为1×10⁹～2×10⁹/mL。

(二)大量培养

1.按1∶100的比例将过夜培养物，加入到一个无菌烧瓶中，烧瓶的体积应不少于培养液体积的5倍。

2.于37℃，约300r/min的速度下培养过夜。

(三)细菌培养的监测

1.利用计数板监测

(1)取一片干净的计数玻片或Pet raff-Hausser小室，盖上干净的盖玻片，参见图1-2。

(2)用小吸管吸取少量培养液，轻轻接触盖玻片的边缘，使液体刚刚充满整个小室。

图1-2　通过计数板计算细菌浓度

(3)在400倍相差显微镜下观察，一个小方块中所见的每个细菌大约相当于2×10⁷/mL，计录细菌数并计算浓度。

2.利用分光光度计监测

(1)将培养液稀释至OD 600＜1。

(2)用分光光度计检测OD值，0.1OD值大约相当于10⁸/mL，计算细菌浓度。

三、在固体培养基中培养

(一)通过连续稀释法滴定和分离细菌菌落

1.取3个无菌培养试管，并标上序号1、2、3，各加5mL LB培养液。

2.吸取5μL细菌培养液，加入1号试管中摇匀，接着从1号试管吸5μL稀释液加入2号试管中摇匀，然后从2号试管再吸5μL稀释液加入3号试管中摇匀。注意每次都使用新的吸头。

3.从每个试管中分别吸取100μL菌液涂布于不同LB平板上，做好记号，待平板干后于37℃培养过夜。

4.按以下方法计算细菌密度:细菌/mL=菌落数×稀释倍数×10。

5.包裹好平板，于4℃保存备用。

(二)通过平板画线法分离单菌落

1.用接种环醮取接种物，从平板的一侧开始画线(如图1-3)，注意无菌操作。

2.重新消毒接种环，冷却后从第一画线处将样品画线至平板的其余部分，重复画线直至覆盖整个平板。

3.于37℃培养直至长出单菌落。

如果要从很多的菌液中分离单克隆，可以将平板分为4、6或8小份，在每个小份中画出单克隆。

(三)通过铺平板分离单个菌落

1.取一只平板，加上0.05～1mL培养物。

2.用接种棒圆周涂布，将培养液涂布均匀，或者用接种棒的边缘在平板的表面画一系列平行线，然后将平板转90°。再重复涂布一次。

3.稍微打开平板盖子，使其完全晾干，于37℃培养。

(四)影印平板

需要同时检测多个细菌菌落在不同条件下的生长能力时，可以采用简便的影印平板法，将细菌菌落从一个平板转移到另一个平板，而保持菌落原有的分布形式不变。

1.用金属环将一块无菌的绒布套在影印模具上。

2.将一个菌落分散均匀的主平板轻轻地压在绒布上。

3.将一个新鲜的平板按主平板的方向轻轻压在影印过的绒布上，使菌落痕迹再影印至新平板上。每块绒布可以影印10个以上的平板。

(五)菌株的保存和复苏

1.穿刺保存

(1)在一个具有可高压灭菌的橡皮塞或Teflon盖的气密性小瓶中加入2/3体积的穿刺培养基。

(2)挑取一个单菌落，将接种环反复深刺入琼脂中。

(3)拧松盖子，于37℃培养(8～12h)直至在穿刺孔迹中的细菌生长呈可见的雾状。

(4)拧紧盖子于15～22℃存放于暗处。

(5)按以下方法复苏菌株:用无菌接种环挑取一些细菌，然后涂布于LB平板上并画线以得到单菌落。

2.冷冻保存

(1)将1mL新鲜饱和的培养液(或者2mL对数生长中期培养液)加至一穿刺小瓶或Nunc小瓶中，这些小瓶中已装有1mL甘油溶液或含7%(V/V)二甲基亚砜(DMSO)^[2]。

(2)保存于－20℃，或－70℃。于－70℃保存时，大多数菌株可维持更长的存活时间。

(3)复苏时，用一无菌牙签或吸管刮取固体冰渣(仔细操作不要让其融化)，然后在LB平板上画线。

四、经典的细菌遗传学选择标志

克隆技术运用了许多经典细菌遗传学的知识，为了便于理解指导书所描述的技术，对有关知识介绍如下。

抗生素是一种能杀死微生物但对真核有机体却相对无毒的化学物质。带有编码抗性基因的质粒和噬菌体载体，导入细菌后，含有这些载体的细菌能在有抗生素存在的培养基中生长并形成菌落而被识别。表1-1给出了在DNA重组工作中常用的抗生素的储藏和工作浓度，以及作用机理。高压蒸汽灭菌后的固体培养基要在温度降至50℃以下时才加入抗生素。在紧急情况下，抗生素可以按上述同样的终浓度直接加到做好的平板上(假定90mm直径的平板含30mL的培养基)。抗生素从平板表面浸润扩散1h足够了。由于很多抗生素(特别是氨苄青霉素)长时间在室温下会失去效力，平板要保存于4℃。另外，利福平和四环素应避光保存(见表1-1)。

表1-1　　　　抗生素的作用及细菌的抗性模式

续表