λ噬菌体的制备

实验四　λ噬菌体的制备

一、实验目的

要求掌握分子生物学实验中从单斑制备λ噬菌体原种的常用方法的原理，以及平板溶解法和液体裂解法λ噬菌体的制备。

二、实验原理

平板溶解法制备原理:将单个空斑的噬菌体与细胞和顶层琼脂混合、铺板。开始时，细胞数多于噬菌体，但噬菌体增长得更快，最后将大部分细胞裂解。然后将顶层琼脂刮下，提取其中的噬菌体，保存。

液体裂解物制备原理:培养至饱和的宿主菌以10⁵～10⁷个噬菌体/mL感染。待噬菌体被吸收后，感染混合物用富营养培养基稀释，剧烈振摇到细胞裂解为止，所有残存的细胞用氯仿裂解，低速离心除去细胞残骸。

三、实验仪器、材料与主要试剂

1.仪器

水浴锅，毛细管或牙签，离心机。

2.材料

λ敏感E·coil菌株。

3.试剂

新鲜上层琼脂、LB培养基、NZC培养基、氯仿、10mmol/L MgCl₂、10mmol/L CaCl₂;

悬浮培养基(SM)(5.8g NaCl，2g MgSO₄·7H₂O，50mL 1mol/L Tris-HCl，pH7.5，0.1%明胶);

稀释缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，20mmol/L MgCl₂)。

四、实验步骤

1.平板溶解法

(1)50倍稀释新鲜过夜培养的λ敏感E.coil菌株，置37℃滚动培养。

(2)加热融化100mL瓶装新鲜顶层琼脂，融化后放于45～50℃水浴中温育。

(3)当细胞密度达到(2～3)×10⁸mL(OD=0.4)时，取0.75～lmL培养液于试管中。₆₀₀用毛细管或牙签挑一个单个新鲜空斑，放入细胞悬液中，轻轻振荡10s。

(4)加7.5mL顶层琼脂，轻荡，将混合物平均倒入3个预温的新鲜平板。

(5)37℃培养，4～6h会出现清晰可见的空斑，并有90%～100%的菌裂解。

(6)吸3mL SM到平皿上。用干净的盖玻片将顶层琼脂从3个平皿上刮到一个小离心管内。

(7)加入3滴氯仿，剧烈混匀10s。

(8)置室温10min。

(9)4℃下10000r/min离心10min。

(10)轻轻倒出并保存上清液。

2.液体裂解物法制备

(1)将大肠杆菌λ敏感株在LB培养基中37℃培养过夜。λ敏感株支持溶解性生长，可通过滴10μL λ裂解物于菌苔上检验，如菌株对λ敏感，在滴加噬菌体的地方将形成空斑。

(2)用无菌牙签或毛细管，挑一个单空斑，放入含0.4mL λ稀释缓冲液的试管中，置4℃下2h，以便噬菌体释出。

(3)用0.1mL洗脱噬菌体溶液与0.1mL饱和培养液和0.1mL 10mmol/L CaCl₂溶液混合，在37℃水浴中温育15min。

(4)将该溶液转入50mL的NZC培养基中，在37℃剧烈摇动培养，直至溶菌(通常需6～8h)。

(5)培养物在6h后应频繁检查，在清亮后立即收获。

(6)加几滴氯仿，以裂解剩下的细胞，将溶液转至Co-rex或Nalgene管(小心，不要带出氯仿)，4℃下10000r/min离心10min，沉降细胞残骸。

(7)尽量保留裂解物，转至螺口盖试管，加几滴氯仿，旋涡振荡，4℃贮存。

五、实验结果

噬菌体裂解物的保存:噬菌体原种应保存于SM培养基中，并加几滴氯仿，置4℃处理过的塑料试管使用起来也不错，也很好用，但较常用螺口盖试管(橡皮衬里或聚四氟乙烯盖，容积至少lmL)。λ滴度可维持数年的时间。噬菌体原种应标明日期并不时测定噬菌体滴度。0.1%的明胶可以减慢噬菌体滴度下降的速度。裂解物也能冰冻贮存在15%的甘油中。

六、思考题

1.平板法除用于制备λ裂解物外，还可以用于什么研究?

2.λ裂解物为什么保存在SM培养基中?