的顺序分析

脱氧核糖核酸（DNA）的顺序分析

1975年以前科学家们曾从不同的角度探索测定DNA顺序的方法。如将DNA转录成RNA，测定了RNA顺序以后，应用互补原理推测DNA的顺序；或用一种核糖核苷酸取代DNA中的脱氧核糖核苷酸，而后用碱或核糖核酸酶（RNase）降解核糖核苷酸键，以求出核苷酸的排列次序；又如将寡核苷酸片段的一端用放射性同位素标记，用外切酶逐个切去非标记端的核苷酸，用双向电泳同系层析法将所得的酶解产物按不同电荷和链长分开以完成核酸的顺序分析等；但这些测定方法都很费时，不够精确，不能普遍应用，而且只能测定一些小的DNA片段。1975年英国F．桑格建立了“加减法”推动了DNA顺序的测定。桑格提出以测定已知末端核苷酸性质的DNA片段的分子长度来推测核苷酸的顺序。这样，过去用于测定生物高分子顺序的基本方法——小片段重叠法的框框被突破了。此后发展起来的各种DNA、RNA顺序测定的新方法都是以这个原理为基础的。

目前被使用得最多的快速可靠的测定DNA顺序的方法是：①F．桑格的双脱氧法；②A．M．马克萨姆和W．吉尔伯特的化学法。

双脱氧法

基本原理是利用DNA聚合酶的聚合反应。在反应混合物中有模板、引物、酶、四种脱氧核苷三磷酸（如dATP）和一定比例的2′，3′双脱氧核苷三磷酸（如ddATP）。因此，在合成过程中，遇到应该参入dATP的位置就有二种可能的情况发生。若dATP参入，则链可以继续延伸，若ddATP参入，合成反应就不能进行了，因为ddATP的3′位置没有羟基。因此，可以得到一系列不同长度的，以ddA为结尾的片段。同理，也可以得到以G、T或C为结尾的片段。经过尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分离以后，就可以直接“读出”核苷酸顺序了。这是一个既方便又精确的方法。双脱氧法需要单链DNA作为模板。70年代后期发展起来的把DNA重组到单链噬菌体中，经增殖之后，可以获得大量的单链DNA。由于这种方法制备的单链DNA是插入到病毒载体的固定位置上，因此靠近插入DNA的末端具有相同的顺序，这就可以利用同一种引物来对付任何待测定的外源DNA。因此大大推动了双脱氧法的发展。后来又用此系统提出了DNA顺序测定的非随机法。其基本原理是利用病毒载体复制点和DNA水解酶将被测定的DNA长链的一端固定，而将靠近引物区的一端逐渐缩短，形成一组长短不同的亚克隆。从中分离出适当的亚克隆后，就可以定向测定整个DNA长链的顺序了。克服了随机法中固有的无用重复测定和寻找特定DNA片段的困难。载体病毒分子越小，能插入的外源DNA链越长，DNA片段分级率越高、非随机法的效率就越高。不少科学家们正在朝这个方向努力。

化学法

马克萨姆和吉尔伯特利用能专一地修饰碱基的化学试剂，使相应的糖苷键变得不稳定，这样也得到以特定碱基决定长度的4组DNA片段。硫酸二甲酯在二甲胂酸存在时可以使鸟嘌呤甲基化。甲基化鸟嘌呤的糖苷键是不稳定的，在碱性溶液中加热，DNA的磷酸二酯键就会在脱鸟嘌呤处断开。电泳之后在放射自显影图上显示出一组由G降解而产生的DNA片段。为测定DNA中A的位置可用稀酸处理使之脱嘌呤，再用碱断开磷酸二酯键，电泳图谱上条带即为A和G。对于嘧啶，可以利用水合肼处理，然后用哌啶催化β消除反应，使磷酸基团掉下。这种处理对C和T没有选择性。但如果在肼解时存在2MNaCl，则抑制了肼同T的反应，这样产生的条带相当于C的位置。