修饰程度和修饰部位的测定

6．2．2　修饰程度和修饰部位的测定

6．2．2．1　分析方法

测定修饰基团和修饰程度的实验方法在文献中已有详细讨论，这里只简述概况。用光谱法追踪检查的方法最简单、最有用，而且还能很容易计算出修饰程度。此法要求修饰后的衍生物具有独特的光谱或它的光谱与修饰剂的不同，但能符合这个条件的试剂并不多。

最常使用的是间接法。被修饰的蛋白质经总降解和氨基酸分析后鉴定修饰部位。被修饰的残基经分离纯化后，可通过它含有的同位素或有色修饰剂的光谱强度、顺磁共振谱、荧光标记量或修饰剂的可逆去除等来测定反应程度。测定一个被修饰氨基酸的出现，要比测定多个相同氨基酸中有一个消失更准确。理想的情况是被修饰的氨基酸残基在水解条件下是稳定的，而且在层析图谱中有一个独特的位置。使用蛋白水解酶降解，一般可避免不稳定问题。但有些修饰了的残基，即使在酶解条件下也不稳定，或者其他残基阻碍蛋白水解酶对相邻肽键的进攻，这时常进行残基部位的第二次修饰，以产生另外一种更稳定的修饰。由第二次修饰的结果，可以得到第一次修饰的程度。例如，已经乙酰化的蛋白质再经二硝基苯酰化，然后酸水解，测定DNP－氨基酸和回收氨基酸的数目，再与总数进行比较，则能知道修饰程度。

6．2．2．2　化学修饰数据的分析

化学修饰中，可以测定许多实验参数，这些参数是与修饰残基的数目及其对蛋白质生物活性的影响相关联的。这里只介绍表示化学修饰数据的最常用的方法以及从这类数据分析中所得到的信息。

时间进程分析数据是化学修饰的基本数据之一。如果修饰过程中有光谱变化，可直接追踪个别侧链的修饰。但常常是追踪修饰对蛋白质某些酶学参数（活性、变构配体的调节作用等）的影响来监测修饰过程。根据获得的时间进程曲线，可以了解修饰残基的性质和数目、修饰残基与蛋白质生物活性之间的关系等。时间进程曲线的测定实际上是蛋白质失活速度常数的测定。在大多数修饰实验中，修饰剂相对于可能修饰的残基是大大过量的，此时可以认为是假一级反应。从残余活性的对数对时间所作的半对数图可求出失活的速度常数。

若蛋白质中有两个以上残基与活性有关，且与修饰剂反应速度很不相同，则所得残余活性对数对修饰时间的半对数图为多相的。

有时修饰剂在修饰反应过程中本身又发生水解作用（如焦碳酸二乙酯），可先在同样条件下实验测定试剂水解的速度常数，然后再求出表观一级失活速度常数K_obs。

在修饰剂与靶蛋白不形成特殊复合物的情况下，K_obs对修饰剂浓度所作的图应为一直线，且通过原点。在有些例子中，如用亲和试剂修饰蛋白质时，在亲和试剂和蛋白质之间先形成可逆的特殊复合物，然后再发生失活作用。这时，由K_obs对试剂浓度作图则得一条双曲线。