重要的天然抗氧剂

10．2．2　重要的天然抗氧剂

目前研究涉及的天然抗氧剂种类十分繁多，选择其比较成熟的品种介绍如下。

10．2．2．1　维生素C与维生素E

维生素C和维生素E在体内和体外都可参与自氧化的氧化还原反应。大量实验证据表明脂类自氧化产生的自由基在均匀的脂相和脂水非均相中交换这两种维生素。在脂自由基、维生素C和维生素E之间自由基的交换反应是很多用维生素C和维生素E混合物保护食油和食物的方法为基础。但是应当注意，脂相是最容易氧化的，也是维生素E的最好溶剂，而维生素C则进不去，这就是为什么要制备抗坏血酸脂，即抗坏血棕榈酸的原因，因为它可以部分溶在脂相中。

抗坏血棕榈酸可以非常有效地保护食物不受氧化变性，特别是有维生素E存在的食物油的保护效果（见表10－6）。对猪油的保护效果只有在很高浓度才表现出来，因为猪油中几乎不含维生素E。从生理的观点十分容易理解，抗坏血棕榈酸很容易模拟抗坏血酸和棕榈酸，在胃肠道中这个脂键被水解正好是人类饮食的正常反应。

表10－6　抗坏血棕榈酸在80℃的抗氧化作用（x天后的过氧化值/（μmol/L））

人们利用EPR研究了水溶性维生素C和脂溶性维生素E之间的作用，证明了抗坏血棕榈酸在第一相中有效地保护了食物的氧化变性，抗坏血棕榈酸被氧化，同时还原了维生素E自由基。在第二相中只有所有的抗坏血棕榈酸被氧化后，维生素E自由基才能被检测到。根据这个实验，有可能用各种不同卵磷脂将维生素C和维生素E融合在一个亲脂相中。

10．2．2．2　β－胡萝卜素

许多植物含有胡萝卜素，它包括α，β，γ－胡萝卜素及玉米黄素。胡萝卜素是维生素A的前体，在β－胡萝卜素15－15′加二氧酶参与下，β－胡萝卜素中心部位2个碳原子与氧作用生成视黄醛。维生素A包括视黄醇（retinol）、视黄醛（retinal）和视黄酸酯（retinyl ester）。维生素A分为A₁和A₂两种。

维生素A是视觉、生殖、维持细胞生长发育等正常功能所必需的。此外，它可调节铜蓝蛋白和血液中的铜，是一种抗氧剂。

β－胡萝卜素的抗氧化作用主要表现为能猝灭单线态氧，也可作为一种自由基捕捉抗氧剂发挥其抗氧化作用。它既可释放能量，又能吸收能量，以此来使其构型发生变化。

β－胡萝卜素在正常摄取量和低于2×10⁴Pa氧压或正常氧压条件下通过共价结合而产生酮或过氧化物并和单线态氧反应；相反在高压氧的条件下则表现出氧化增强作用，产生一系列副作用或毒性，这就是临床上所见服用过量维生素所产生的副反应。如使体内维生素E的氧化加速，则维生素C在体内减少，SOD、GSH含量下降。

目前，由β－胡萝卜素对细胞分化的调节功能而表现出的抗癌作用，已在临床上受到重视。

10．2．2．3　谷胱甘肽

谷胱甘肽是一种由甘氨酸、半胱氨酸和γ－谷氨酸组成的含巯基的非蛋白抗氧剂。GSH是机体内所含的非蛋白巯基化合物数量最多和巯基数最高的化合物，高达500×10^－9mol/g～1　000×10^－9mol/g组织，而氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量较少，正常情况下GSH/GSSG为500（见表10－7）。

表10－7　某些组织中SH基化合物的含量

图10－6　抗坏血酸和α－生育酚的往返机制及其在体内的氧化还原链

GSH在整个机体氧化还原链中和维持机体内环境处于自稳态方面起着关键性作用，这是由其本身的结构和生化性质所决定的。

GSH在抗坏血酸和α－生育酚氧化还原链中可使脱氢抗坏血酸在抗坏血酸还原酶作用下还原成抗坏血酸，最新报道已用实验证实人红血球可摄取细胞外之DHA（甘二碳六烯酸）在细胞内还原成抗坏血酸，以维持细胞内的自稳态。在红血球内还原型抗坏血酸的再生是依赖于大量的GSH。而GSH可通过化学的或酶促反应极为迅速地直接将DHA还原成抗坏血酸。此报道并认为此还原途径不包括抗坏血酸自由基。

此外，GSH和NADPH偶联使细胞内之LOOH还原成LOH。

总之GSH是一个极为重要的抗氧剂，可清除自由基。GSSG/GSH的比值反映了体内的氧化还原水平。

10．2．2．4　金属硫蛋白

金属硫蛋白（metallothionein，MT）是指一类低相对分子质量、高巯基含量、能大量结合重金属离子、性能独特的蛋白质。由于含半胱氨酸（25%～30%）且能结合重金属（Zn，Cr，Ag，Hg等），故称为金属硫蛋白。

MT具有的结构特征决定了它具有的及其重要的生理功能：①清除自由基及抗辐射作用，保护细胞损伤，防止细胞衰老；②参与金属代谢调节，具有重金属解毒作用；③MT是“看家”基因编码的蛋白质，在胚胎发育、生长、分化过程中起着重要的调控作用。

特别是MT具有清除自由基能力，故是有效的细胞保护剂。实验表明，MT能显著减轻细胞缺氧/高氧的损伤，增加细胞的存活率，降低细胞内Ca^2＋的积累，抑制膜脂过氧化。用马来酰亚胺作为自旋标记红细胞膜来研究MT的抗辐射和抗自由基的作用，当引入自由基或γ－射线作用于红细胞膜时，结果表明含有MT的基质红细胞膜比对照组受损伤程度要小得多，过氧化程度明显低，红细胞膜构象没有受到破坏。

目前，从研究小分子含硫化合物发展到含硫蛋白等大分子化合物，从植物中分离出植物含硫蛋白，用基因工程技术制备较大量的富硫蛋白供研究和应用。给家兔注射大剂量硫酸锌可诱导体内合成大量的金属硫蛋白，用转基因海藻细胞合成MT。同时，还纯化出ZnMT₁和ZnMT₂。通过可见吸收光谱和荧光发射光谱法发现MT尚可对自由基损伤有修复作用。最新研究结果表明MT可使红血球溶血减少，且ZnMT₁比ZnMT₂作用明显。用EPR波谱和自旋标记法证明MT有清除羟自由基和拮抗电离辐射的能力，其清除羟自由基的能力次序为ZnMT₂＞ZnMT₁＞CdMT₂＞CdMT₁。最新研究结果证明ZnMT₂基因可在各种类型细胞和器官中表达，而MT₁基因表达的专一性更强。据此可解释，不同亚型MT基因非等同表达而产生生理功能的差异。此外，还要特别注意研究含硫化合物的免疫增强作用与抗氧化作用的关系。

10．2．2．5　银杏叶提取物

银杏叶提取物作为药物，始于20世纪70年代，这种药物适用于冠心病，并取得了一些疗效。当时，德、法两国将银杏叶提取物用于治疗脑血管疾病，取得较好疗效。之后生产银杏叶制剂的国家发展到美国、瑞士、日本、比利时等国。在我国有很多生产厂家，其中以天宝宁规模较大，销售市场也从欧洲发展到美洲，近年又进入香港和台湾地区，年销售额高达10亿美元以上。

银杏叶提取物临床上主要用来治疗脑供血不足和早期的神经退行性病变，能缓解头昏、头痛、眩晕，改善和增强记忆力等。银杏叶提取物的作用可能是单个活性成分或多种活性成分共同作用的结果，最重要的是黄酮类和萜类，而银杏内酯是其特有的。痴呆是由于神经元的丢失，传递功能受损及产生自由基引起脂质过氧化等原因造成的。银杏叶提取物的不同组分通过不同机理作用于不同阶段来减轻智力功能障碍。

（1）改善血液循环作用。脑缺血可以引起低氧、能量代谢障碍及代谢产物蓄积，实验证实EGb能增加脑血流及改善微循环，大鼠经30min的EGb处理后，明显延长低氧状态下的存活期，这主要由于它所含的银杏内酯（ginkgolides）具有抗血小板激活因子（PAF）的作用，能降低血液黏稠度和红细胞聚集，从而改善血液的流变性，降低毛细血管的通透性。

（2）保护脑组织抗脑水肿的作用。脑水肿是由外伤或毒物引起神经组织水潴留造成的，分为细胞毒性和血管源性两种。在三乙基锡（triethyltin）细胞毒损伤的大鼠脑水肿模型中，EGb有对抗脑水肿的作用，它能防止缺血缺氧引起的氧化磷酸化脱偶联反应，保持线粒体的正常呼吸，维持钠泵功能，防止水钠潴留及其引起的一系列病理过程，其作用主要与银杏内酯有关。

（3）清除自由基保护神经细胞。EGb有清除多种自由基的作用，是一种广谱的自由基清除剂。我们的实验表明它具有清除羟自由基、超氧阴离子自由基和一氧化氮，抑制脂质过氧化的作用，其作用强度与自由的酚羟基数目有关，5OH（myricetin）＞4OH（quercetin）＞3OH（fisetin，kaempferol，rutin），其结构中呋喃环上C2～C3位间双键和B环两个邻位羟基基团是作用所必需的。

10．2．2．6　不同结构五味子素对氧自由基的清除作用链

五味子的有效成分包括一组五味子素，主要有五味子酚（Sal）、五味子醇甲（SolA）、五味子甲素（SinA）、五味子乙素（SinB），其结构如图10－7所示，这些结构不同的五味子素具有不同的药理作用。为了探讨它们药用作用不同的根源，我们用自旋捕集技术研究了不同结构五味子素在不同体系中对氧自由基的清除作用，结果发现，结构不同的五味子素对氧自由基的清除作用不同。

图10－7　五味子素的分子结构

表10－8　五味子素对氧自由基的清除率/%

由表10－8中的数据可以看出五味子素SolA和SinB对Fenton反应的羟基自由基的清除作用都是很强的，远远超过维生素E，甚至超过维生素C。在光照核黄素体系五味子素SinB对超氧阴离子自由基的清除能力比对超氧阴离子自由基清除能力强。

五味子素对羟基自由基的清除能力远远大于对超氧阴离子自由基的清除能力说明，五味子素对细胞和组织的保护作用可能是通过清除体内产生的羟基自由基起作用的。

比较五味子醇甲和五味子乙素的结构可以发现，它们的结构很类似，唯一的区别是五味子乙素上有一个二氧甲基基团少了两个甲氧基。我们知道甲氧基是斥电子基团，而二氧甲基基团是吸电子基团。在一个分子同时存在一个斥电子基团和一个吸电子基团时，必然导致分子在某个区域缺电子，这个区域正好是自由基进攻的位点，这可能是造成SinB比SolA清除氧自由基效果好的原因。

（2）不同构型五味子素对氧自由基的清除作用。生物合成和酶的催化反应，不仅对底物和反应物的结构有特异的要求，而且还常常有异构体的要求，例如生物合成几乎都要求L－构型的氨基酸。药物分子也是如此，结构相同，构型不同，其药效可能相差很远。在分离五味子有效成分时发现每种结构的五味子素还具有不同异构体，它们的药理作用也可能有所不同，因此本节讨论这一问题。我们的实验发现，相同结构而构型不同的五味子素其清除氧自由基的能力也有区别。

图10－8　几种五味子素的异构体

10．2．2．7　茶多酚

茶多酚占茶叶干重的30%左右。科学实验表明，茶多酚能有效地清除氧自由基和脂类自由基，预防脂质过氧化、延缓机体衰老等。这里重点介绍茶多酚对不同体系氧自由基的清除作用。

（1）茶多酚对超氧阴离子自由基的清除作用。为了定量测定茶多酚对超氧阴离子自由基的清除作用，利用光照核黄素/EDTA体系产生超氧阴离子自由基。当把茶多酚和其他抗氧剂加入这一体系后，超氧阴离子自由基被不同程度地清除。表10－9列出了茶多酚和其他几种抗氧剂对超氧阴离子自由基的清除率，由表10－9中的数据可以看出，维生素C对这一光照体系产生的超氧阴离子自由基的清除率最大，其次是两种茶多酚，再其次是玫瑰香精和维生素E，姜黄素的清除率最低。

表10－9　茶多酚等天然抗氧剂对光照核黄素/EDTA体系产生超氧阴离子自由基的清除作用/%

（2）茶多酚对羟基自由基的清除作用。为了定量测定茶多酚对羟基自由基的清除作用，利用Fenton反应产生羟基自由基。当把茶多酚和其他抗氧剂加入这一体系后，羟基自由基被不同程度地清除。表10－10列出了茶多酚和这几种抗氧剂对羟基自由基的清除率。由表10－10中的数据可以看出姜黄素对这一体系中产生的羟基自由基的清除率最大，其次是维生素C和维生素E，两种茶多酚和玫瑰香精对这一体系产生的羟基自由基的清除作用不明显。

表10－10　茶多酚对Fenton反应产生的羟基自由基的清除作用/%

（3）茶多酚清除氧自由基的协同作用。茶多酚是一种多酚类物质，它包含四种单体成分，其结构如图10－9所示。这四种单体对氧自由基的清除作用也是不同的，它们混合在一起对氧自由基的清除有协同作用和最佳清除比例。

图10－9　茶多酚的四个单体的结构式

（4）四种儿茶素对氧自由基的清除效率。由于这四种儿茶素的结构不同，它们对氧自由基的清除效率也不一样，表10－11给出了用化学发光法和ESR技术测量的结果。

表10－11　茶多酚四种单体对超氧阴离子自由基的清除率/（nmol/L）

由表中的数据可以看出具有较多酚羟基的儿茶素具有较强的抗氧化能力。这几种儿茶素对氧自由基的清除能力按以下关系递减：EGCG＞ECG＞EC＞EGC。

10．2．2．8　丹参酮对氧自由基的清除作用

丹参的有效成分包括丹参酮（tanshinone）、隐丹参酮（cryptotanshinone）、二氢丹参酮（dihydrotanshenone）、丹参素（danshensu）、丹参酸（danshensuan）等。丹参酮是脂溶性的，丹参素是水溶性的。临床应用较多的还是丹参提取液，其中包括各种有效成分。丹参酮及其磺酸化的水溶性衍生物也被用于临床。

图10－10　丹参酮和丹参素的分子结构

（1）丹参素对超氧阴离子自由基的清除作用。用DMPO捕集的黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶体系产生的超氧阴离子自由基的ESR波谱，在反应体系中加入不同浓度的丹参素，就会对超氧阴离子自由基产生不同的清除作用。实验表明，2×10^－5mol/L丹参素可以清除大约57%的超氧阴离子自由基，2×10^－4mol/L丹参素几乎清除了所有的超氧阴离子自由基，IC₅₀大约为1．5×10^－5mol/L。在这一浓度范围内，没有发现丹参酮对这一体系产生的超氧阴离子自由基有任何清除作用，只有当丹参酮浓度高达2．3×10^－3mol/L时，才能清除大约27%的超氧阴离子自由基。

（2）丹参对心肌缺血再灌流损伤产生氧自由基的清除作用。图10－11为家兔缺血再灌流心肌在低温的ESR波谱及在灌流液中加入SOD，过氧化氢酶或丹参注射液对ESR波谱的影响。由图可以看出，在缺血再灌流心肌中有一个g＝2．004　5和g＝2．040　0的氧自由基信号，加入SOD以后，这一信号几乎完全清除，加入过氧化氢酶只能部分清除这一信号，加入丹参注射液可以和加入SOD一样完全清除氧自由基信号。

图10－11　丹参酮对心肌缺血再灌流损伤产生自由基的清除作用

a．缺血再灌流心肌；b．缺血再灌流加SOD心肌；c．缺血再灌流加过氧化氢酶心肌；d．缺血再灌流加丹参心肌

（3）丹参素对大鼠心肌缺血再灌流致线粒体变化的影响。离体大鼠心脏随机分为四组：分别为对照组，有氧灌流40分钟；缺血组，停止灌流40分钟；再灌流组，停止灌流40分钟后再有氧灌流20分钟；丹参素组，预先用含有4×10^－6mol/mL丹参素灌流液灌流后再进行缺血再灌流。实验结果表明，线粒体膜脂质过氧化物含量，缺血组为2．51±0．48nmol/mg蛋白，缺血再灌流组为3．02±0．63nmol/mg蛋白，都明显高于对照组的1．94±0．35nmol/mg蛋白，P值小于0．01。而丹参素组为1．66±0．56nmol/mg蛋白，与对照组相比无显著差异。利用ESR自旋标记技术研究线粒体膜流动性发现，在线粒体膜深层，缺血再灌流组的序参数和旋转相关时间分别为S＝0．112±0．006和τc＝（7．13±0．09）×10^－10s，比对照组的S＝0．103±0．007和τc＝（6．86±0．20）×10^－10s显著降低，而丹参素组的S＝0．109±0．005和τc＝（6．94±0．12）×10^－10s与对照组相比无显著差异。